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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达和SDS-PAGE
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

[求助] 原核表达和SDS-PAGE

我做的4个基因的克隆 然后转到pET-28a上了，然后进行了一系列的检测，都合适了，最后跑SDS-PAGE，具体操作如下：
将检测合适的转到BL21(DE3)里的保存的菌液 摇菌 37度过夜；
第二天，1:50的比例转摇；
OD600=0.6-0.8时停止转摇（时间是下午2点），
然后置于4度，待晚上7点加IPTG诱导，28度，过夜（体积为20ml）
次日，将诱导好的，没有诱导的，离心，收集上清，并将沉淀加灭过菌的水稀释至总体积为20ml,然后超声波处理
然后跑SDS-PAGE，
浓缩胶为4% 分离胶为12%
结果什么都没有  
不知道为什么  
文献上看别人都是这样做的啊 为什么我的就是不行呢？
麻烦大家帮忙分析一下！
谢谢！
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1楼 2013-01-08 14:31:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
什么都没有是什么意思？SDS-PAGE染胶没有条带吗？还是说没有诱导出特异的条带？确定超声破碎的效果了吗？如果菌破了，总会有细菌自己的蛋白吧。超声所得的蛋白是可溶蛋白，有可能诱导的蛋白形成包涵体了。可以试试上细菌总蛋白，看有没有诱导出来。此外，IPTG诱导条件（温度、时间、浓度）都和蛋白有关，需要自己优化。单纯按文献来是不行的。
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2楼2013-01-08 14:50:15
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-08 14:50:15
什么都没有是什么意思？SDS-PAGE染胶没有条带吗？还是说没有诱导出特异的条带？确定超声破碎的效果了吗？如果菌破了，总会有细菌自己的蛋白吧。超声所得的蛋白是可溶蛋白，有可能诱导的蛋白形成包涵体了。可以试试上 ...

是SDS-PAGE胶上只有marker 其他什么都没有的  疯了我快  
超声波是按说明书上的做的  振2s间歇4s然后功率是80% 时间是10min
IPTG诱导了12小时，28度  
就是最后把样和2*SDS-PAGE上样缓冲液混合后没有煮 是不是也有影响呢  
我就差这张跑胶的图了  就可以结束研究生实验了  
死活出不来   我快郁闷死了
天天脚都跑的累的  但胶就是什么都没有  
实在是。。。
希望给点好的建议
谢谢
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3楼2013-01-08 21:02:29
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用20ml做表达，最后又用20ml重悬，蛋白浓度当然会很低。
如果破菌做可溶性鉴定，我一般是4ml菌液，离心后，菌体沉淀用1ml buffer重悬，超声破菌，高速离心后，上清取样100ul电泳，其余丢弃，沉淀用100ul buffer重悬，与上清一起电泳检测，观察蛋白是否可溶性表达还是包涵体表达。
如果在上清中就是可溶性表达，在沉淀中就是包涵体表达。很多时候上清和沉淀中都有，就是部分可溶性表达。
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生物资源交流QQ群：1044518333
4楼2013-01-08 21:25:54
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用的是Novagen的pET系统，建议你参考pET系统操作手册，这可能是做原核表达最经典的实验手册。
http://lifeserv.bgu.ac.il/wb/zar ... system%20manual.pdf
里面有关于pET系统的表达，纯化等相关的具体信息，祝好运！
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5楼2013-01-08 21:49:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-09 12:00:29
引用回帖:
3楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2013-01-08 21:02:29
是SDS-PAGE胶上只有marker 其他什么都没有的  疯了我快  
超声波是按说明书上的做的  振2s间歇4s然后功率是80% 时间是10min
IPTG诱导了12小时，28度  
就是最后把样和2*SDS-PAGE上样缓冲液混合后没有煮 是不是 ...

菌的超声一般是挺好做的，超声时候菌浓度的确不能太稀，否则可溶蛋白的浓度小，需要上样量大才能看到。一般是留取1/10的菌，离心，用500ul上样buffer重悬，煮5min，这个算是预留的菌体总蛋白。剩余的菌液离心，积浓缩5倍去超声。取超声后应该看到菌体从浑浊变得有些透明。当然如果形成大量包涵体的话，还是浑浊的。超好的样品离心取上清。取100ul样品+100上样buffer变性，算是可溶蛋白部分，剩余超好的样品冻存。沉淀用超声时同样体积的水重悬，取100ul加100ul上样buffer变性，为沉淀部分。分别取5-10ul的各个样品电泳检测。
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6楼2013-01-09 07:53:57
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406856929

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

溶解时体积过大是个问题，但是如果诱导效果好的话，目的条带也是应该有的，因为诱导蛋白有时会比背景蛋白浓度高几十倍。如果只是看看表达效果，不需要分可溶性蛋白和包涵体蛋白的话，可以直接将细菌离心下来，重悬，煮样跑胶
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7楼2013-01-16 13:16:35
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 406856929 at 2013-01-16 13:16:35
溶解时体积过大是个问题，但是如果诱导效果好的话，目的条带也是应该有的，因为诱导蛋白有时会比背景蛋白浓度高几十倍。如果只是看看表达效果，不需要分可溶性蛋白和包涵体蛋白的话，可以直接将细菌离心下来，重悬， ...

离心后加了30微升的PBS重悬，然后煮了6分钟，结果跑前点样的时候发现还拉丝呢  不知道能不能出啦结果
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8楼2013-01-16 19:52:58
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 406856929 at 2013-01-16 13:16:35
溶解时体积过大是个问题，但是如果诱导效果好的话，目的条带也是应该有的，因为诱导蛋白有时会比背景蛋白浓度高几十倍。如果只是看看表达效果，不需要分可溶性蛋白和包涵体蛋白的话，可以直接将细菌离心下来，重悬， ...

重悬了后取了15微升的样，15微升的上样缓冲液  结果拉丝
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9楼2013-01-16 19:54:08
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juinia

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2013-01-16 19:54:08
重悬了后取了15微升的样，15微升的上样缓冲液  结果拉丝...

拉丝的话不怕麻烦就超声一下，就不会拉丝了
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10楼2014-07-07 10:36:09
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