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蛋白之家

新虫 (小有名气)

[求助] 原核表达和SDS-PAGE

我做的4个基因的克隆 然后转到pET-28a上了,然后进行了一系列的检测,都合适了,最后跑SDS-PAGE,具体操作如下:
将检测合适的转到BL21(DE3)里的保存的菌液 摇菌 37度过夜;
第二天,1:50的比例转摇;
OD600=0.6-0.8时停止转摇(时间是下午2点),
然后置于4度,待晚上7点加IPTG诱导,28度,过夜(体积为20ml)
次日,将诱导好的,没有诱导的,离心,收集上清,并将沉淀加灭过菌的水稀释至总体积为20ml,然后超声波处理
然后跑SDS-PAGE,
浓缩胶为4% 分离胶为12%
结果什么都没有  
不知道为什么  
文献上看别人都是这样做的啊 为什么我的就是不行呢?
麻烦大家帮忙分析一下!
谢谢!
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 406856929 at 2013-01-16 13:16:35
溶解时体积过大是个问题,但是如果诱导效果好的话,目的条带也是应该有的,因为诱导蛋白有时会比背景蛋白浓度高几十倍。如果只是看看表达效果,不需要分可溶性蛋白和包涵体蛋白的话,可以直接将细菌离心下来,重悬, ...

重悬了后取了15微升的样,15微升的上样缓冲液  结果拉丝
9楼2013-01-16 19:54:08
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
什么都没有是什么意思?SDS-PAGE染胶没有条带吗?还是说没有诱导出特异的条带?确定超声破碎的效果了吗?如果菌破了,总会有细菌自己的蛋白吧。超声所得的蛋白是可溶蛋白,有可能诱导的蛋白形成包涵体了。可以试试上细菌总蛋白,看有没有诱导出来。此外,IPTG诱导条件(温度、时间、浓度)都和蛋白有关,需要自己优化。单纯按文献来是不行的。
2楼2013-01-08 14:50:15
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-08 14:50:15
什么都没有是什么意思?SDS-PAGE染胶没有条带吗?还是说没有诱导出特异的条带?确定超声破碎的效果了吗?如果菌破了,总会有细菌自己的蛋白吧。超声所得的蛋白是可溶蛋白,有可能诱导的蛋白形成包涵体了。可以试试上 ...

是SDS-PAGE胶上只有marker 其他什么都没有的  疯了我快  
超声波是按说明书上的做的  振2s间歇4s然后功率是80% 时间是10min
IPTG诱导了12小时,28度  
就是最后把样和2*SDS-PAGE上样缓冲液混合后没有煮 是不是也有影响呢  
我就差这张跑胶的图了  就可以结束研究生实验了  
死活出不来   我快郁闷死了
天天脚都跑的累的  但胶就是什么都没有  
实在是。。。
希望给点好的建议
谢谢
3楼2013-01-08 21:02:29
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你用20ml做表达,最后又用20ml重悬,蛋白浓度当然会很低。
如果破菌做可溶性鉴定,我一般是4ml菌液,离心后,菌体沉淀用1ml buffer重悬,超声破菌,高速离心后,上清取样100ul电泳,其余丢弃,沉淀用100ul buffer重悬,与上清一起电泳检测,观察蛋白是否可溶性表达还是包涵体表达。
如果在上清中就是可溶性表达,在沉淀中就是包涵体表达。很多时候上清和沉淀中都有,就是部分可溶性表达。
VX:19192310212;公众号:生物技术与IVD
4楼2013-01-08 21:25:54
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