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原核表达和SDS-PAGE
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我做的4个基因的克隆 然后转到pET-28a上了，然后进行了一系列的检测，都合适了，最后跑SDS-PAGE，具体操作如下： 将检测合适的转到BL21(DE3)里的保存的菌液 摇菌 37度过夜； 第二天，1:50的比例转摇； OD600=0.6-0.8时停止转摇（时间是下午2点）， 然后置于4度，待晚上7点加IPTG诱导，28度，过夜（体积为20ml） 次日，将诱导好的，没有诱导的，离心，收集上清，并将沉淀加灭过菌的水稀释至总体积为20ml,然后超声波处理 然后跑SDS-PAGE， 浓缩胶为4% 分离胶为12% 结果什么都没有 不知道为什么 文献上看别人都是这样做的啊 为什么我的就是不行呢？ 麻烦大家帮忙分析一下！ 谢谢！ |
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2楼2013-01-08 14:50:15
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-09 12:00:29
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菌的超声一般是挺好做的，超声时候菌浓度的确不能太稀，否则可溶蛋白的浓度小，需要上样量大才能看到。一般是留取1/10的菌，离心，用500ul上样buffer重悬，煮5min，这个算是预留的菌体总蛋白。剩余的菌液离心，积浓缩5倍去超声。取超声后应该看到菌体从浑浊变得有些透明。当然如果形成大量包涵体的话，还是浑浊的。超好的样品离心取上清。取100ul样品+100上样buffer变性，算是可溶蛋白部分，剩余超好的样品冻存。沉淀用超声时同样体积的水重悬，取100ul加100ul上样buffer变性，为沉淀部分。分别取5-10ul的各个样品电泳检测。 |
6楼2013-01-09 07:53:57
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