应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：这样的蛋白表达纯化结果如何解释好？
191/2返回列表12下一页
查看: 2094  |  回复: 18
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

haoranjob

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助：这样的蛋白表达纯化结果如何解释好？已有8人参与

我在做一个细菌基因的原核表达，载体用pRSETB（T7，His6），表达系统为大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，LB，37摄氏度，IPTG（1mM）诱导5~7h后，结果：诱导0，1，2，3，4，5，6，7h全菌及全菌破碎上清液（均为2mL菌液制备）的SDS-PAGE在预期位置均没有出现逐渐增粗的表达条带，但分别在活性条件和变性条件下处理细菌（0.5g湿重细菌）得到细菌破碎上清液，过HisTrap HP柱子纯化后（缓冲液按Qiagen方法配制，但没加PMSF），洗脱下来的蛋白产物却是单一条带（但与目的蛋白大小92kDa有差别，有时大于有时小于），而且活性条件和变性条件下得到的蛋白大小不一样（相差20多KDa），请问我这样的结果能说明目的基因在大肠杆菌实现了原核表达吗？为什么会出现这样的情况，如何解释呢？培养方法和纯化方法还需要作哪些优化？因为已经没时间做western-blot或酶活性试验等特异性实验验证了……
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2009-05-21 20:32:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

haoranjob

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by dianaofyezi at 2009-5-22 11:24:
并不是所有的蛋白表达时候都会随着时间的延长而表达量增加的，这是第一点要强调的地方。如果和载体对照比较有蛋白表达带出来就可以初步说表达了，但是有一点要知道，某些蛋白再不需要诱导的时候也会出现表达，这个 ...

测序是正确，ORF也正确！目的蛋白理论分子量为92KDa
上图
M：高分子量蛋白 Marker
1：阴性对照，经诱导表达 6h 的携带空载体 pRSETB 的大肠杆菌破碎上清液
2-7：分别为经诱导表达 6，5，4，3，2，1h 的携带原核表达质粒的大肠杆菌破碎上清液
8：为未经诱导的携带原核表达质粒的大肠杆菌破碎上清液

下图
M：高分子量蛋白 Marker
A1：活性条件下处理得到的蛋白洗脱液
B4：变性条件下处理得到的蛋白洗脱液

这样的情况可以说明目的基因实现了表达吗？如何解释是好？都要答辩了，WB是没时间做的了，只好解释分析结果了……

[ Last edited by haoranjob on 2009-5-22 at 18:14 ]
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2009-05-22 18:07:49
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

dianaofyezi

金虫 (正式写手)
以你的描述来说蛋白肯定没有表达。1.你的细菌基因是否为酶类物质，是否导致细菌的某些蛋白降解等2.该外源基因的特点是什么，是否为膜蛋白，或者特殊的结构等3.你说PAGE结果没有发现组建变粗的条带，那说明是有蛋白表达的么？和什么对照的呢?4.纯化的蛋白出现大小不一定情况，可能是纯化工艺的问题，并没有纯化触目的蛋白，没有表达的原因会非常多，请自己分析，good luck！
赞一下 回复此楼
52187644
2楼2009-05-21 21:42:25
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

haoranjob

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by dianaofyezi at 2009-5-21 21:42:
以你的描述来说蛋白肯定没有表达。1.你的细菌基因是否为酶类物质，是否导致细菌的某些蛋白降解等2.该外源基因的特点是什么，是否为膜蛋白，或者特殊的结构等3.你说PAGE结果没有发现组建变粗的条带，那说明是有蛋白 ...

是酶的一个亚基，应该不会降解其他蛋白吧，本来细菌（包括大肠杆菌）就有这个酶；
不是膜蛋白；
正常来讲，若目的蛋白表达了，应该看到随着诱导时间增加逐渐变粗的蛋白条带嘛，但我的没有，和诱导前的细菌和空载体细菌做对照啊；
但纯化有与目的蛋白大小接近的产物，因为His标签的特异性还是比较高，出现前后不一致的结果，不知如何解释

[ Last edited by haoranjob on 2009-5-21 at 22:16 ]
赞一下 回复此楼
3楼2009-05-21 22:10:55
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifefamily

首先，你构建好的质量测序过了么？有没有确定你的克隆是正确构建的？
赞一下 回复此楼
4楼2009-05-22 08:41:44
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dianaofyezi

金虫 (正式写手)
并不是所有的蛋白表达时候都会随着时间的延长而表达量增加的，这是第一点要强调的地方。如果和载体对照比较有蛋白表达带出来就可以初步说表达了，但是有一点要知道，某些蛋白再不需要诱导的时候也会出现表达，这个在大肠杆菌中还是存在的，应该注意。至于说你WB的结果，我想第一应该考虑楼上的建议——是否测序，是否序列正确。然后表达后蛋白（假定表达了）和你附近的蛋白到底有多大差别，做WB的一抗是什么，蛋白是否表达之后容易降解，或者存在修饰问题等等。
赞一下 回复此楼
52187644
5楼2009-05-22 11:24:25
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

haoranjob

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lifefamily at 2009-5-22 08:41:
首先，你构建好的质量测序过了么？有没有确定你的克隆是正确构建的？

当然测序了，而且序列正确的，ORF也正确的，His6加在目的蛋白N端，编码733个氨基酸，92KDa
赞一下 回复此楼
6楼2009-05-22 18:03:46
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mimisikai

金虫 (小有名气)
强烈建议做WB  花不了多少时间 但是数据就很有说服力了  否则答辩时老师问到了 你怎么解释？难道说猜想的？ 还是需要试验证明的
赞一下 回复此楼
8楼2009-05-22 18:34:11
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

月月大可

木虫 (著名写手)
我现在也遇到这种情况了，ORF完全正确，但是转入BL21（DE3）后，诱导前和诱导后没有明显的差别，也没有在预期大小的地方出现条带
赞一下 回复此楼
9楼2009-05-23 09:05:01
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

haoranjob

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by mimisikai at 2009-5-22 18:34:
强烈建议做WB  花不了多少时间 但是数据就很有说服力了  否则答辩时老师问到了 你怎么解释？难道说猜想的？ 还是需要试验证明的

不可能了，还有一个星期就答辩了，
赞一下 回复此楼
10楼2009-05-23 10:54:09
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 haoranjob 的主题更新
191/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复(可上传附件) 论文翻译-EnPapers美助理教授团队-SCI英文润色
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 入职高校3年发表10+SCI，尽人事听天命 +33 kaoyan250 2024-05-27 47/2350 2024-06-02 18:25 by kaoyan250
[基金申请] 离职后国自然项目不能变更单位，在新单位还能申请新的国自然项目吗 5+3 宜兰 2024-05-31 10/500 2024-06-02 17:50 by 月五年子庚
[基金申请] 为什么美国要封锁华为而不封锁丘C同呢？ +6 zju2000 2024-06-02 7/350 2024-06-02 16:12 by sxjc500
[基金申请] 九部门发文：不得将专利授权数量作为人才评价、项目评审、职称评定、高校评价等的条件 +17 sjtu2012 2024-05-28 21/1050 2024-06-02 13:43 by 欢乐颂叶蓁
[论文投稿] 编辑对文章提的意见 40+3 qa8386136 2024-06-01 3/150 2024-06-02 13:28 by bobvan
[考博] 求生物学的博导收留 +5 申博成功功成博� 2024-06-01 5/250 2024-06-02 13:19 by 小虫子咔咔
[硕博家园] 论大家对6070后普通教授导师的看法 +7 SNaiL1995 2024-05-28 11/550 2024-06-02 13:16 by 小虫子咔咔
[教师之家] 职能部门工作人员态度不好是普遍的吗？怎么让他们态度好一些？ +4 河西夜郎 2024-06-01 4/200 2024-06-02 09:14 by 摩天思瑞
[硕博家园] 每到中夜，情难自抑 +34 sioc-sunj 2024-05-28 58/2900 2024-06-02 02:53 by csyky2007
[考博] 申请2024或2025年博士研究生 +5 嘟噜嘟1 2024-05-29 12/600 2024-06-01 22:36 by 嘟噜嘟1
[考博] 24or25材料专业申博 +4 农夫三拳有点痛 2024-05-30 11/550 2024-06-01 14:45 by Napoleonsky
[基金申请] B口人才项目 +9 WOWO159357 2024-05-29 19/950 2024-06-01 14:24 by linxuhuizj
[考博] 申博求助?本硕双非一篇三区和四区去985工科非天坑专业有没有希望？ +4 LYS1200 2024-05-29 6/300 2024-06-01 08:50 by 学术渣渣神
[硕博家园] 求问endnote上Wiley引用格式在哪下载 +3 Elon. 2024-05-30 3/150 2024-05-31 10:13 by crazy peng
[论文投稿] 有没有老师需要发表论文 +4 金老师论文助理- 2024-05-29 4/200 2024-05-29 16:51 by liuyupu132
[论文投稿] 高手朋友推荐比较容易投稿和录用的SCI期刊，不投稿收费SC，对分区没有要求 5+3 xintangren 2024-05-28 4/200 2024-05-29 10:46 by xintangren
[基金申请] 如果您是国自然评审专家 +3 丁香园账户 2024-05-28 3/150 2024-05-29 06:44 by gaohui8888
[论文投稿] EI学报，一审返修后，为啥不再送审，直接终审中? +4 qweasd12345 2024-05-27 6/300 2024-05-29 00:02 by dut_ameng
[基金申请] E10开始送了，希望有好运 +5 sail 2024-05-27 5/250 2024-05-28 18:36 by 芝小芝
[有机交流] 奇怪的物质 100+4 桃桃PXS 2024-05-27 7/350 2024-05-28 10:22 by 091602
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭