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475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] 蛋白的表达量低不稳定怎么办

我在做肌红蛋白的原核表达，但是表达水平很低，但活性还可以。本来带有His标签，但是挂不上柱，用SP柱可以除去部分杂蛋白，但是透析的时候蛋白就会沉淀下来，离心后上清活性也是可以的，继续做稳定性时发现在4℃的稳定性很差，3周就降解的差不多没有了，但-20℃没问题是稳定的。
现在请假大家：
1.如何提高表达量，我是从温度、时间、IPTG浓度都试过了
2.如何提高稳定性，我的Buffer是20/25mM Tris pH7.5  1mM EDTA、0.02%叠氮钠  0.01%SDS

因为蛋白再透析时就产生沉淀，但上清仍有活性，我改变过他们的pH
和含氯化钠的量，最高加到100mM，但是透析还是有沉淀
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
1楼 2013-01-06 14:13:03
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 475502411 at 2013-01-06 16:34:02
三氯化铁吗？浓度多高呢？
谢谢...

活性形式应该是二价铁，10μM FeSO4，母液在酸性形式下配置。在空气中二价铁会氧化成三价铁。
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4楼2013-01-07 02:39:49
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-06 16:34:13
肌红蛋白蛋白结合heme，一般的说结合cofactor后的蛋白比apo形式更稳定。你试试在缓冲液中加点铁。
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2楼2013-01-06 15:10:34
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-06 15:10:34
肌红蛋白蛋白结合heme，一般的说结合cofactor后的蛋白比apo形式更稳定。你试试在缓冲液中加点铁。

三氯化铁吗？浓度多高呢？
谢谢
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3楼2013-01-06 16:34:02
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-07 02:39:49
活性形式应该是二价铁，10μM FeSO4，母液在酸性形式下配置。在空气中二价铁会氧化成三价铁。...

请问怎么配置啊，我不明白，能不能详细说一下啊？谢谢
我的蛋白是上清表达，有His标签，但是His标签可能是没有暴露出来，挂不上镍柱，用阳离子柱效果还可以，0.5M的NaCl洗脱下来目的蛋白，但我想把盐透掉，结果一透析就有蛋白沉淀，沉淀的蛋白有杂蛋白也有目的蛋白，并且离心取上清的活性还是可以的，但就是在4度不稳定，但在-20度还是稳定的。所以不知道怎么改善？》
不透析除去盐行吗？
谢谢
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5楼2013-01-10 13:44:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 475502411 at 2013-01-10 13:44:42
请问怎么配置啊，我不明白，能不能详细说一下啊？谢谢
我的蛋白是上清表达，有His标签，但是His标签可能是没有暴露出来，挂不上镍柱，用阳离子柱效果还可以，0.5M的NaCl洗脱下来目的蛋白，但我想把盐透掉，结果一 ...

FeSO4配置的时候需要溶解在稀硫酸里。如果是直接溶在水里你试一下就知道了，在空气中浅绿色的Fe2+会很快被氧化，形成棕色的不溶物。
不知道你纯化蛋白后续实验要做什么。如果高浓度的NaCl不影响，不除也没事。一定的离子强度可以避免蛋白质在高浓度下聚合沉淀。你可以试试把样品透析到稍微低一点的盐浓度的缓冲液里。此外，你是否在分离纯化样品过程中加了甘油？甘油可以增强目的蛋白的稳定性，尤其是对除去了多数杂蛋白的纯化样品。
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6楼2013-01-11 09:02:10
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nlbtr

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

嗯，甘油可以增强稳定性，还有，你确定原核表达是最佳的解决方案么？个人觉得真核会更好些。
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7楼2013-01-11 09:12:36
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by nlbtr at 2013-01-11 09:12:36
嗯，甘油可以增强稳定性，还有，你确定原核表达是最佳的解决方案么？个人觉得真核会更好些。

但是实验室真核表达还不成熟，原核能表达出来，并且有活性，就不想去做真核了。
我们是做胶体金检测抗原标准品的，可以使高盐的，我再做一下在高盐条件下的稳定性，试一试
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8楼2013-01-11 13:13:13
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-11 09:02:10
FeSO4配置的时候需要溶解在稀硫酸里。如果是直接溶在水里你试一下就知道了，在空气中浅绿色的Fe2+会很快被氧化，形成棕色的不溶物。
不知道你纯化蛋白后续实验要做什么。如果高浓度的NaCl不影响，不除也没事。一定 ...

我的透析液成分是：20mMTris  1mM的EDTA  0.01%SDS   0.02%叠氮钠
没有用甘油，不过SDS也有这样的作用

你帮我看看是不是透析液有问题
不过应该不会，这是我们实验室常用的透析液
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9楼2013-01-11 13:15:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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★ ★ ★ ★ ★
475502411: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-11 15:47:33
引用回帖:
9楼: Originally posted by 475502411 at 2013-01-11 13:15:03
我的透析液成分是：20mMTris  1mM的EDTA  0.01%SDS   0.02%叠氮钠
没有用甘油，不过SDS也有这样的作用

你帮我看看是不是透析液有问题
不过应该不会，这是我们实验室常用的透析液...

透析液是可以的。如果盐对你的酶活影响不大的话，可以在透析液里加上一些NaCl，比方说100mM。或者做分步透析，就是不要一步就上无盐的透析液，先只降一些，慢慢降下来。
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10楼2013-01-11 14:16:16
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