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铜虫 (著名写手)

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[求助] 蛋白的表达量低不稳定怎么办

我在做肌红蛋白的原核表达，但是表达水平很低，但活性还可以。本来带有His标签，但是挂不上柱，用SP柱可以除去部分杂蛋白，但是透析的时候蛋白就会沉淀下来，离心后上清活性也是可以的，继续做稳定性时发现在4℃的稳定性很差，3周就降解的差不多没有了，但-20℃没问题是稳定的。
现在请假大家：
1.如何提高表达量，我是从温度、时间、IPTG浓度都试过了
2.如何提高稳定性，我的Buffer是20/25mM Tris pH7.5 1mM EDTA、0.02%叠氮钠 0.01%SDS

因为蛋白再透析时就产生沉淀，但上清仍有活性，我改变过他们的pH
和含氯化钠的量，最高加到100mM，但是透析还是有沉淀

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可以朝九晚五，也能浪迹天涯

1楼 2013-01-06 14:13:03

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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【答案】应助回帖

引用回帖:

5楼: Originally posted by 475502411 at 2013-01-10 13:44:42
请问怎么配置啊，我不明白，能不能详细说一下啊？谢谢
我的蛋白是上清表达，有His标签，但是His标签可能是没有暴露出来，挂不上镍柱，用阳离子柱效果还可以，0.5M的NaCl洗脱下来目的蛋白，但我想把盐透掉，结果一 ...

FeSO4配置的时候需要溶解在稀硫酸里。如果是直接溶在水里你试一下就知道了，在空气中浅绿色的Fe2+会很快被氧化，形成棕色的不溶物。
不知道你纯化蛋白后续实验要做什么。如果高浓度的NaCl不影响，不除也没事。一定的离子强度可以避免蛋白质在高浓度下聚合沉淀。你可以试试把样品透析到稍微低一点的盐浓度的缓冲液里。此外，你是否在分离纯化样品过程中加了甘油？甘油可以增强目的蛋白的稳定性，尤其是对除去了多数杂蛋白的纯化样品。