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475502411

铜虫 (著名写手)

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[求助] 蛋白的表达量低不稳定怎么办

我在做肌红蛋白的原核表达，但是表达水平很低，但活性还可以。本来带有His标签，但是挂不上柱，用SP柱可以除去部分杂蛋白，但是透析的时候蛋白就会沉淀下来，离心后上清活性也是可以的，继续做稳定性时发现在4℃的稳定性很差，3周就降解的差不多没有了，但-20℃没问题是稳定的。
现在请假大家：
1.如何提高表达量，我是从温度、时间、IPTG浓度都试过了
2.如何提高稳定性，我的Buffer是20/25mM Tris pH7.5 1mM EDTA、0.02%叠氮钠 0.01%SDS

因为蛋白再透析时就产生沉淀，但上清仍有活性，我改变过他们的pH
和含氯化钠的量，最高加到100mM，但是透析还是有沉淀

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可以朝九晚五，也能浪迹天涯

1楼 2013-01-06 14:13:03

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
475502411: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-11 15:47:33

引用回帖:

9楼: Originally posted by 475502411 at 2013-01-11 13:15:03
我的透析液成分是：20mMTris 1mM的EDTA 0.01%SDS 0.02%叠氮钠
没有用甘油，不过SDS也有这样的作用

你帮我看看是不是透析液有问题
不过应该不会，这是我们实验室常用的透析液...

透析液是可以的。如果盐对你的酶活影响不大的话，可以在透析液里加上一些NaCl，比方说100mM。或者做分步透析，就是不要一步就上无盐的透析液，先只降一些，慢慢降下来。