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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白的表达量低不稳定怎么办
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475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] 蛋白的表达量低不稳定怎么办

我在做肌红蛋白的原核表达，但是表达水平很低，但活性还可以。本来带有His标签，但是挂不上柱，用SP柱可以除去部分杂蛋白，但是透析的时候蛋白就会沉淀下来，离心后上清活性也是可以的，继续做稳定性时发现在4℃的稳定性很差，3周就降解的差不多没有了，但-20℃没问题是稳定的。
现在请假大家：
1.如何提高表达量，我是从温度、时间、IPTG浓度都试过了
2.如何提高稳定性，我的Buffer是20/25mM Tris pH7.5  1mM EDTA、0.02%叠氮钠  0.01%SDS

因为蛋白再透析时就产生沉淀，但上清仍有活性，我改变过他们的pH
和含氯化钠的量，最高加到100mM，但是透析还是有沉淀
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
1楼 2013-01-06 14:13:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
475502411: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-11 15:47:33
引用回帖:
9楼: Originally posted by 475502411 at 2013-01-11 13:15:03
我的透析液成分是：20mMTris  1mM的EDTA  0.01%SDS   0.02%叠氮钠
没有用甘油，不过SDS也有这样的作用

你帮我看看是不是透析液有问题
不过应该不会，这是我们实验室常用的透析液...

透析液是可以的。如果盐对你的酶活影响不大的话，可以在透析液里加上一些NaCl，比方说100mM。或者做分步透析，就是不要一步就上无盐的透析液，先只降一些，慢慢降下来。
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10楼2013-01-11 14:16:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-06 16:34:13
肌红蛋白蛋白结合heme，一般的说结合cofactor后的蛋白比apo形式更稳定。你试试在缓冲液中加点铁。
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2楼2013-01-06 15:10:34
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-06 15:10:34
肌红蛋白蛋白结合heme，一般的说结合cofactor后的蛋白比apo形式更稳定。你试试在缓冲液中加点铁。

三氯化铁吗？浓度多高呢？
谢谢
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
3楼2013-01-06 16:34:02
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 475502411 at 2013-01-06 16:34:02
三氯化铁吗？浓度多高呢？
谢谢...

活性形式应该是二价铁，10μM FeSO4，母液在酸性形式下配置。在空气中二价铁会氧化成三价铁。
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4楼2013-01-07 02:39:49
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