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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pcr测序后发现有重叠现象
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Cllair

金虫 (小有名气)

[求助] pcr测序后发现有重叠现象

提取出来基因，跑胶后条带很亮，切胶回收后去测序，发现有重叠现象，已经纯化分离测序了很多次了每次都是有重叠现象，实在不知道怎么办呢，请诸位指点一下吧。还有就是我想把该基因直接和t载体连接后去测质粒，这样是不是会好一点呢。江湖急救，高手帮忙啊。
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有今生没来世，且行且珍惜。
1楼 2012-12-11 22:16:23
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
最好还是连载体吧，可能是引物不太好！
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2楼2012-12-11 22:17:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR产物是有可能不是单一序列，跑胶一条带只能说明分子量很接近。连到载体上挑单克隆再去测序比较保险。
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3楼2012-12-12 08:09:11
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 追梦的人1987 at 2012-12-11 22:17:33
最好还是连载体吧，可能是引物不太好！

我也觉得引物不太好，十次会有九次p不成功，但是相关资料少，引物就能设计到这个份上了。谢谢了哈。
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4楼2012-12-12 16:00:06
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-12 08:09:11
PCR产物是有可能不是单一序列，跑胶一条带只能说明分子量很接近。连到载体上挑单克隆再去测序比较保险。

恩啊，很有道理。我现在担心的是，如果真是同一个引物p出来的分子量相近的两条带的话，连接到载体上面会不会都能连上去呢，毕竟引物上面的酶切位点也是一样的。。。。
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有今生没来世，且行且珍惜。
5楼2012-12-12 16:06:15
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Cllair at 2012-12-12 16:06:15
恩啊，很有道理。我现在担心的是，如果真是同一个引物p出来的分子量相近的两条带的话，连接到载体上面会不会都能连上去呢，毕竟引物上面的酶切位点也是一样的。。。。...

怎么，你回收时，条带离的很近吗
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6楼2012-12-12 16:25:57
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by Cllair at 2012-12-12 16:06:15
恩啊，很有道理。我现在担心的是，如果真是同一个引物p出来的分子量相近的两条带的话，连接到载体上面会不会都能连上去呢，毕竟引物上面的酶切位点也是一样的。。。。...

即使如此，单克隆里面只能是一个序列，拿去测序正确就可以了。
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7楼2012-12-13 08:09:53
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shsDerek

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换引物和酶试试，模板没问题的话就应该是这个问题，换个 高保真度的酶
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8楼2012-12-13 08:28:50
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
两种可能：模板本身不纯；引物特异性不高。最近我碰到过后面情况，换引物后解决了。
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9楼2012-12-14 14:32:37
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 追梦的人1987 at 2012-12-12 16:25:57
怎么，你回收时，条带离的很近吗...

回收时只看到一条带。。。
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有今生没来世，且行且珍惜。
10楼2012-12-14 16:16:58
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