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494750284

木虫 (小有名气)

[求助] 酶切所得片段与预期不符

我的插入基因大小为970+，由PCR获得。引物两端酶切位点分别为EcoR I和 BamH I，插入片段内部不含上述酶切位点。
因为PCR效率比较低，所以以第一次PCR产物稀释100倍作为模板进行了第二次PCR，切胶回收后跑电泳验证，除了浓度降低，大小没变。
接下来，我将970+目的基因插入到pEASY-T1 simple vector, 蓝白斑筛选白色菌落，小提质粒，双酶切，切下来的目的基因却只有300多。各位虫友帮忙分析分析，太奇怪了！
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1楼2012-12-05 14:12:22
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 积极应助，热心交流 2012-12-05 17:23:20
494750284: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-12-05 21:43:39
494750284: 金币+3, ★★★★★最佳答案, 重新做了一次，成功了。那个诡异的问题现在还是没搞明白。我十分肯定不是胶回收错了 2012-12-13 09:14:58
不知楼主你挑取了几个白色菌落，小提质粒的？
1. 如果楼主挑了很多的话，抽出来的质粒双酶切，目的片段都只有300多的话，那可能就是PCR切胶回收的问题了，是不是回收错了条带，因为根据楼主描述，似乎条带大小在PCR时是对的。
2. 如果只挑了一个或者两个白色菌落做质粒抽提双酶切，然后得到300多的条带，不能说明剩下的所有白色菌落都是阴性克隆，这时楼主可以做个菌落PCR筛选试试
3. 还有楼主确信两次PCR扩出来的条带大小都是符合预期的，按你的描述，说两次PCR，浓度都很低，感觉产物像是非特异性的产物，假如这非特异性条带中间有EcoRI或者BamHI的话，就正好把条带给切了到300bp

个人意见，仅供参考！
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2楼2012-12-05 15:39:09
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seanzhu1996

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-12-05 17:23:32
494750284: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2012-12-05 21:44:41
检查pEASY-T1 simple vector中是否有EcoR I和 BamH I两个位点。根据你的描述，你的PCR产物的回收浓度较低，而且还是以第一次PCR产物为模板进行的扩增，有可能引入差异，导致位点变化，建议找好条件以后用原始模板重做PCR，然后再做克隆。
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享受每天的生活
3楼2012-12-05 15:40:40
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494750284

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2012-12-05 15:39:09
不知楼主你挑取了几个白色菌落，小提质粒的？
1. 如果楼主挑了很多的话，抽出来的质粒双酶切，目的片段都只有300多的话，那可能就是PCR切胶回收的问题了，是不是回收错了条带，因为根据楼主描述，似乎条带大小在PC ...

打了这么多字，真实辛苦了，谢谢。
我的片段问题，设计引物扩增效率比较低。第一次PCR得出目的条带，位置正确，亮度较低。第二次PCR得出三条带：目的条带位置正确，另外两条非特异性扩增。我确定回收条带肯定是没错的。
第二个问题，我那个转化只出来了零星几个菌落，4个蓝色的，两三个白色的。挑了两个白色的。针对这个，我重新买了Takara的T载体，打算明天重新做一次。
第三个问题：我将得到的质粒送去测了一下序，306个bp与NCBI完全吻合。应该分析一下，这个吻合片段有什么特点。
唉，构建载体原理简单，咋就这么麻烦呢。。。。。
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4楼2012-12-05 21:40:28
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494750284

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by seanzhu1996 at 2012-12-05 15:40:40
检查pEASY-T1 simple vector中是否有EcoR I和 BamH I两个位点。根据你的描述，你的PCR产物的回收浓度较低，而且还是以第一次PCR产物为模板进行的扩增，有可能引入差异，导致位点变化，建议找好条件以后用原始模板重 ...

嗯，引入变异是个可能的原因。不过根据测序的结果，可能性不大。已经决定重做了，但是，我这个人偶尔喜欢钻牛角尖，跟大家讨论讨论
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5楼2012-12-05 21:43:04
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