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494750284木虫 (小有名气)
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酶切所得片段与预期不符
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我的插入基因大小为970+，由PCR获得。引物两端酶切位点分别为EcoR I和 BamH I，插入片段内部不含上述酶切位点。 因为PCR效率比较低，所以以第一次PCR产物稀释100倍作为模板进行了第二次PCR，切胶回收后跑电泳验证，除了浓度降低，大小没变。 接下来，我将970+目的基因插入到pEASY-T1 simple vector, 蓝白斑筛选白色菌落，小提质粒，双酶切，切下来的目的基因却只有300多。各位虫友帮忙分析分析，太奇怪了！    |
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 【分子生物】EPI帖 |
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seanzhu1996
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3楼2012-12-05 15:40:40
gyesang
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不知楼主你挑取了几个白色菌落，小提质粒的？ 1. 如果楼主挑了很多的话，抽出来的质粒双酶切，目的片段都只有300多的话，那可能就是PCR切胶回收的问题了，是不是回收错了条带，因为根据楼主描述，似乎条带大小在PCR时是对的。 2. 如果只挑了一个或者两个白色菌落做质粒抽提双酶切，然后得到300多的条带，不能说明剩下的所有白色菌落都是阴性克隆，这时楼主可以做个菌落PCR筛选试试 3. 还有楼主确信两次PCR扩出来的条带大小都是符合预期的，按你的描述，说两次PCR，浓度都很低，感觉产物像是非特异性的产物，假如这非特异性条带中间有EcoRI或者BamHI的话，就正好把条带给切了到300bp 个人意见，仅供参考！ |
2楼2012-12-05 15:39:09
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