应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切所得片段与预期不符
51/1返回列表
查看: 1328  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

494750284

木虫 (小有名气)

[求助] 酶切所得片段与预期不符

我的插入基因大小为970+，由PCR获得。引物两端酶切位点分别为EcoR I和 BamH I，插入片段内部不含上述酶切位点。
因为PCR效率比较低，所以以第一次PCR产物稀释100倍作为模板进行了第二次PCR，切胶回收后跑电泳验证，除了浓度降低，大小没变。
接下来，我将970+目的基因插入到pEASY-T1 simple vector, 蓝白斑筛选白色菌落，小提质粒，双酶切，切下来的目的基因却只有300多。各位虫友帮忙分析分析，太奇怪了！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-12-05 14:12:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

494750284

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2012-12-05 15:39:09
不知楼主你挑取了几个白色菌落，小提质粒的？
1. 如果楼主挑了很多的话，抽出来的质粒双酶切，目的片段都只有300多的话，那可能就是PCR切胶回收的问题了，是不是回收错了条带，因为根据楼主描述，似乎条带大小在PC ...

打了这么多字，真实辛苦了，谢谢。
我的片段问题，设计引物扩增效率比较低。第一次PCR得出目的条带，位置正确，亮度较低。第二次PCR得出三条带：目的条带位置正确，另外两条非特异性扩增。我确定回收条带肯定是没错的。
第二个问题，我那个转化只出来了零星几个菌落，4个蓝色的，两三个白色的。挑了两个白色的。针对这个，我重新买了Takara的T载体，打算明天重新做一次。
第三个问题：我将得到的质粒送去测了一下序，306个bp与NCBI完全吻合。应该分析一下，这个吻合片段有什么特点。
唉，构建载体原理简单，咋就这么麻烦呢。。。。。
赞一下 回复此楼
4楼2012-12-05 21:40:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 5 个回答

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 积极应助，热心交流 2012-12-05 17:23:20
494750284: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-12-05 21:43:39
494750284: 金币+3, ★★★★★最佳答案, 重新做了一次，成功了。那个诡异的问题现在还是没搞明白。我十分肯定不是胶回收错了 2012-12-13 09:14:58
不知楼主你挑取了几个白色菌落，小提质粒的？
1. 如果楼主挑了很多的话，抽出来的质粒双酶切，目的片段都只有300多的话，那可能就是PCR切胶回收的问题了，是不是回收错了条带，因为根据楼主描述，似乎条带大小在PCR时是对的。
2. 如果只挑了一个或者两个白色菌落做质粒抽提双酶切，然后得到300多的条带，不能说明剩下的所有白色菌落都是阴性克隆，这时楼主可以做个菌落PCR筛选试试
3. 还有楼主确信两次PCR扩出来的条带大小都是符合预期的，按你的描述，说两次PCR，浓度都很低，感觉产物像是非特异性的产物，假如这非特异性条带中间有EcoRI或者BamHI的话，就正好把条带给切了到300bp

个人意见，仅供参考！
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2012-12-05 15:39:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

seanzhu1996

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-12-05 17:23:32
494750284: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2012-12-05 21:44:41
检查pEASY-T1 simple vector中是否有EcoR I和 BamH I两个位点。根据你的描述，你的PCR产物的回收浓度较低，而且还是以第一次PCR产物为模板进行的扩增，有可能引入差异，导致位点变化，建议找好条件以后用原始模板重做PCR，然后再做克隆。
赞一下 回复此楼
享受每天的生活
3楼2012-12-05 15:40:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

494750284

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by seanzhu1996 at 2012-12-05 15:40:40
检查pEASY-T1 simple vector中是否有EcoR I和 BamH I两个位点。根据你的描述，你的PCR产物的回收浓度较低，而且还是以第一次PCR产物为模板进行的扩增，有可能引入差异，导致位点变化，建议找好条件以后用原始模板重 ...

嗯，引入变异是个可能的原因。不过根据测序的结果，可能性不大。已经决定重做了，但是，我这个人偶尔喜欢钻牛角尖，跟大家讨论讨论
赞一下 回复此楼
5楼2012-12-05 21:43:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 5 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +5 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-31 01:37 by hZiFeudZyoGR
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +5 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-31 01:07 by hZiFeudZyoGR
[论文投稿] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +6 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 8/400 2026-08-31 00:54 by hZiFeudZyoGR
[公派出国] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +7 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 10/500 2026-08-31 00:42 by hZiFeudZyoGR
[考博] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-31 00:21 by hZiFeudZyoGR
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 4FFAWE8HcgUD 2026-08-29 4/200 2026-08-30 20:40 by hZiFeudZyoGR
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 4FFAWE8HcgUD 2026-08-29 4/200 2026-08-30 20:30 by hZiFeudZyoGR
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 4FFAWE8HcgUD 2026-08-29 3/150 2026-08-30 20:10 by hZiFeudZyoGR
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 zICmwzsBXjbN 2026-08-29 5/250 2026-08-30 20:08 by hZiFeudZyoGR
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 4/200 2026-08-30 19:34 by hZiFeudZyoGR
[考博] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 18:20 by hZiFeudZyoGR
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 17:47 by hZiFeudZyoGR
[基金申请] 面上意见出来了 +9 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 18/900 2026-08-30 16:47 by 黄鸟于飞Chao
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[文学芳草园] 梦想 +3 myrtle 2026-08-26 3/150 2026-08-27 10:01 by angelyueyi
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭