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霸_霸

新虫 (初入文坛)

[求助] 帮我看一下 关于霉菌提基因组进行pcr的实验 做不粗来啊

先说我的霉菌dna提取方法：
  1：取一定量菌体放入ep管中，加入0.8ml溶液1（山梨醇0.9mol/l+0.1mol/lEDTA），加入0.1ml蜗牛酶30mg/ml，37℃水浴1h，离心去上清液。
  2：沉淀加入0.8ml溶液2（tris 50mmol/l，20mmol/lEDTA），加入0.1ml 10%SDS水浴65℃30min，加入醋酸钾冰浴1h。
  3：离心取上清，加入等体积苯酚氯仿异戊醇（25 24 1），离心取上清，加入二倍体积乙醇沉淀dna。
  4：dna溶于TE缓冲液中备用。


  之后进行5.8s pcr扩增，但是我所做的霉菌种只有一个霉菌可以扩增出来别的霉菌扩增不出来。
  我分析应该还是DNA提取的问题，请高手指点一下，真的很发愁啊，以下是我dna的电泳图，和pcr的电泳图。

这个是DNA电泳图



这个是PCR后的电泳图
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1楼 2012-05-11 15:17:19
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家

【答案】应助回帖

★ ★
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西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-11 17:42:11
哦，提DNA的方法细节上有一点点问题，抽提蛋白就只用酚：氯仿：异戊醇（25/24/1）抽提一次？？那残留的酚怎么办~？通常我们都会在这一步之后再用氯仿：异戊醇（24/1）抽一次，再用氯仿抽一次，这样蛋白和酚都除得比较干净了。还有，加二倍体积的无水乙醇沉淀也不是不行啦，但是乙醇又不贵，为什么不能加到三倍体积呢？这样沉淀效率会高一点，避免损失吧。
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3楼2012-05-11 16:21:38
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-11 17:41:44
两个电泳都木有marker。。。这是个什么意思啊？提DNA的电泳看起来右边那个还好啊，就是RNA多了点，也没什么关系，左边的浓度比较低，但做PCR应该没问题吧。至于PCR的图，由于没marker，不知道到底是什么，就不予评论了。
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2楼2012-05-11 16:16:26
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