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donnafeng金虫 (小有名气)
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蛋白浓缩沉淀？二硫键？
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我的蛋白质单体含3个半胱氨酸 可能2-4聚体 ni柱纯化后过脱盐柱 浓缩蛋白时 出现沉淀 用透析袋加聚乙二醇浓缩时 浓缩到一定程度后 蛋白浓缩液在透析带里是澄清的 挤压几次透析带立刻出现白色沉淀 而用超滤浓缩管浓缩到一定程度后 溶液澄清澄清，枪头吹打几次以后立刻出现沉淀 1 到底是为什么呢 是因为吹打或者是挤压的过程导致二硫键的生成吗？ 如果是这种情况浓缩过程加DTT可以吗 2 这个蛋白活性形式是二聚体形式 其他来源的这个蛋白有晶体结构 怎么看pdb文件看这个二聚体是不是有二硫键连接 用pymol软件能看出来吗？ 3 如果活性形式是通过二硫键形成的二聚体 是不是就不能加DTT呢？ 怎么才能让它以二聚体的形式存在而不是其他形式存在呢？ 4 我的这个蛋白是胞内酶 大肠杆菌胞内是还原性条件 是不是所有胞内酶都没有二硫键 而是以半胱氨酸的活性形式存在？那是不是在破碎细胞这一步的时候就因该加DTT [ Last edited by donnafeng on 2012-5-2 at 11:02 ] |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
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1 到底是为什么呢 是因为吹打或者是挤压的过程导致二硫键的生成吗？ 如果是这种情况浓缩过程加DTT可以吗 白色沉淀应该是由于蛋白质在脱盐（透析、超滤）后，溶液中的盐浓度降低后，蛋白质表面的带电集团相互作用形成盐键，引起蛋白质聚集，和二硫键的应该是关系不大，其他蛋白质脱盐后，也有可能会聚集而沉降的。 2 这个蛋白活性形式是二聚体形式 其他来源的这个蛋白有晶体结构 怎么看pdb文件看这个二聚体是不是有二硫键连接 用pymol软件能看出来吗？ 这个软件没有用过。一般软件是以不同的颜色显示所有半胱氨酸残基，看硫原子之间的空间关系，原子间的距离不知道能否显示，能的话直接读取距离，判断有无化学键形成 3 如果活性形式是通过二硫形成的二聚体 是不是就不能加DTT呢？ 怎么才能让它以二聚体的形式存在而不是其他形式存在呢？ 这个就不懂了，在体外较难操作。最好是保持和体内存在时一直的pH值，盐浓度，让蛋白构象不发生变化，其他半胱氨酸残基在空间上不能接近就好了 4 我的这个蛋白是胞内酶 大肠杆菌胞内是还原性条件 是不是所有胞内酶都没有二硫键 而是以半胱氨酸的活性形式存在？那是不是在破碎细胞这一步的时候就因该加DTT 这些就不明白了。 |
2楼2012-05-02 14:49:44
donnafeng
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3楼2012-05-02 16:00:55
【答案】应助回帖
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吹打它或者是挤压透析袋， 不过是一个诱导体系有不稳定状态到稳定状态的一个因素 就像水在加热时，有时超过沸点不沸腾，用玻璃棒摩擦一下杯壁马上沸腾 当然，水在凝结过程中也有类似现象发生 还有过饱和溶液析出溶质时，也是这样！ 形成二硫键是化学反应，那么低浓度的溶液，反应速度绝不会有那么快，何况氧气溶解速度也不会如此迅速的！ |
4楼2012-05-02 17:52:12
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<大肠杆菌二硫键形成相关蛋白的结构、功能及其在基因工程表达外源蛋白上的应用>张众黄华木梁 这篇文章里说“体内蛋白质二硫键的形成是在细胞中特定的部位完成 的。在大肠杆菌中，二硫键的形成一般仅限于细胞膜蛋白和 分泌蛋白［2］。大肠杆菌的胞质是一高度还原的环境，不包含 具有稳定二硫键的蛋白［5］。而且，许多胞质还原酶必须以巯 基为活性基团，所以胞质中存在特定的还原系统确保蛋白巯 基的还原状态［8-10］。高度氧化的大肠杆菌周质腔具有形成 二硫键所具备的一切条件，尤其是具有形成二硫键所必需的 酶类———Dsb蛋白，事实上，大肠杆菌蛋白质 二硫键的形成大多都是在周质腔完成的［11］。” 我的理解就是大肠杆菌胞质里的酶就是没有二硫键的 除非是膜蛋白或者分泌蛋白 |
9楼2012-05-03 14:05:30
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浓度高了都会沉淀，有时候表象你看不出来，但是加入外力后瞬间表现。这可能是你吹打造成的，或者是蛋白已经过饱和，吹打后表现出来了。 可以考虑增加盐浓度，加入稳定剂，或者底物或者底物类似物。 pdb文件很多工具都可以打开，pymol， wincoot。后者我们解析结构时候多用。 没说二聚体是搞二硫键形成的吧，即使靠加入dtt或者β巯基乙醇也是可以的。二者在pH7-8之间的半衰期都很短，几十分钟到几小时。具体时间不记得了，自己查查吧，和温度 ph有密切关系。 他们在降解的过程中二硫键缓慢形成趋于稳定。 多数半胱氨酸都是游离形式的，形成二硫键的情况一般不多。 |
10楼2012-05-03 16:10:40
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