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donnafeng金虫 (小有名气)
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蛋白浓缩沉淀？二硫键？
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我的蛋白质单体含3个半胱氨酸 可能2-4聚体 ni柱纯化后过脱盐柱 浓缩蛋白时 出现沉淀 用透析袋加聚乙二醇浓缩时 浓缩到一定程度后 蛋白浓缩液在透析带里是澄清的 挤压几次透析带立刻出现白色沉淀 而用超滤浓缩管浓缩到一定程度后 溶液澄清澄清，枪头吹打几次以后立刻出现沉淀 1 到底是为什么呢 是因为吹打或者是挤压的过程导致二硫键的生成吗？ 如果是这种情况浓缩过程加DTT可以吗 2 这个蛋白活性形式是二聚体形式 其他来源的这个蛋白有晶体结构 怎么看pdb文件看这个二聚体是不是有二硫键连接 用pymol软件能看出来吗？ 3 如果活性形式是通过二硫键形成的二聚体 是不是就不能加DTT呢？ 怎么才能让它以二聚体的形式存在而不是其他形式存在呢？ 4 我的这个蛋白是胞内酶 大肠杆菌胞内是还原性条件 是不是所有胞内酶都没有二硫键 而是以半胱氨酸的活性形式存在？那是不是在破碎细胞这一步的时候就因该加DTT [ Last edited by donnafeng on 2012-5-2 at 11:02 ] |
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 【分子生物】EPI帖 |
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西瓜: 金币+4, Good！ 2012-05-03 17:52:33
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浓度高了都会沉淀，有时候表象你看不出来，但是加入外力后瞬间表现。这可能是你吹打造成的，或者是蛋白已经过饱和，吹打后表现出来了。 可以考虑增加盐浓度，加入稳定剂，或者底物或者底物类似物。 pdb文件很多工具都可以打开，pymol， wincoot。后者我们解析结构时候多用。 没说二聚体是搞二硫键形成的吧，即使靠加入dtt或者β巯基乙醇也是可以的。二者在pH7-8之间的半衰期都很短，几十分钟到几小时。具体时间不记得了，自己查查吧，和温度 ph有密切关系。 他们在降解的过程中二硫键缓慢形成趋于稳定。 多数半胱氨酸都是游离形式的，形成二硫键的情况一般不多。 |
10楼2012-05-03 16:10:40