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donnafeng

金虫 (小有名气)

[求助] 蛋白浓缩沉淀？二硫键？

我的蛋白质单体含3个半胱氨酸 可能2-4聚体   ni柱纯化后过脱盐柱  浓缩蛋白时  出现沉淀  用透析袋加聚乙二醇浓缩时  浓缩到一定程度后 蛋白浓缩液在透析带里是澄清的    挤压几次透析带立刻出现白色沉淀    而用超滤浓缩管浓缩到一定程度后 溶液澄清澄清，枪头吹打几次以后立刻出现沉淀            
1 到底是为什么呢     是因为吹打或者是挤压的过程导致二硫键的生成吗？ 如果是这种情况浓缩过程加DTT可以吗
2  这个蛋白活性形式是二聚体形式  其他来源的这个蛋白有晶体结构  怎么看pdb文件看这个二聚体是不是有二硫键连接  用pymol软件能看出来吗？
3  如果活性形式是通过二硫键形成的二聚体  是不是就不能加DTT呢？ 怎么才能让它以二聚体的形式存在而不是其他形式存在呢？
4 我的这个蛋白是胞内酶 大肠杆菌胞内是还原性条件 是不是所有胞内酶都没有二硫键  而是以半胱氨酸的活性形式存在？那是不是在破碎细胞这一步的时候就因该加DTT

[ Last edited by donnafeng on 2012-5-2 at 11:02 ]
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1楼2012-05-02 10:03:32
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回帖置顶 ( 共有1个 )

chaijudi

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
西瓜: 金币+3, MolEPI+1, Good！一起授予EPI！ 2012-05-02 18:54:12
donnafeng: 金币+50, ★★★★★最佳答案 2012-05-03 08:25:03
吹打它或者是挤压透析袋，
不过是一个诱导体系有不稳定状态到稳定状态的一个因素

就像水在加热时，有时超过沸点不沸腾，用玻璃棒摩擦一下杯壁马上沸腾
当然，水在凝结过程中也有类似现象发生
还有过饱和溶液析出溶质时，也是这样！

形成二硫键是化学反应，那么低浓度的溶液，反应速度绝不会有那么快，何况氧气溶解速度也不会如此迅速的！
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4楼2012-05-02 17:52:12
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chaijudi

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
donnafeng: 金币+5, ★有帮助 2012-05-02 16:02:47
西瓜: 金币+4, 鼓励热心应助！ 2012-05-02 18:53:56
1 到底是为什么呢     是因为吹打或者是挤压的过程导致二硫键的生成吗？ 如果是这种情况浓缩过程加DTT可以吗
白色沉淀应该是由于蛋白质在脱盐（透析、超滤）后，溶液中的盐浓度降低后，蛋白质表面的带电集团相互作用形成盐键，引起蛋白质聚集，和二硫键的应该是关系不大，其他蛋白质脱盐后，也有可能会聚集而沉降的。
2  这个蛋白活性形式是二聚体形式  其他来源的这个蛋白有晶体结构  怎么看pdb文件看这个二聚体是不是有二硫键连接  用pymol软件能看出来吗？
这个软件没有用过。一般软件是以不同的颜色显示所有半胱氨酸残基，看硫原子之间的空间关系，原子间的距离不知道能否显示，能的话直接读取距离，判断有无化学键形成
3  如果活性形式是通过二硫形成的二聚体  是不是就不能加DTT呢？ 怎么才能让它以二聚体的形式存在而不是其他形式存在呢？
这个就不懂了，在体外较难操作。最好是保持和体内存在时一直的pH值，盐浓度，让蛋白构象不发生变化，其他半胱氨酸残基在空间上不能接近就好了
4 我的这个蛋白是胞内酶 大肠杆菌胞内是还原性条件 是不是所有胞内酶都没有二硫键  而是以半胱氨酸的活性形式存在？那是不是在破碎细胞这一步的时候就因该加DTT
这些就不明白了。
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2楼2012-05-02 14:49:44
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donnafeng

金虫 (小有名气)
1"白色沉淀应该是由于蛋白质在脱盐（透析、超滤）后，溶液中的盐浓度降低后，蛋白质表面的带电集团相互作用形成盐键，引起蛋白质聚集，和二硫键的应该是关系不大，其他蛋白质脱盐后，也有可能会聚集而沉降的。"问题是在我剧烈的动它之前它是澄清的  我才怀疑吹打它或者是挤压透析袋这一类操作引入氧气 二硫键氧化？
3大肠杆菌胞内的ph值盐浓度具体是多少呢？
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3楼2012-05-02 16:00:55
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ruoshui183

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
donnafeng: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-05-03 08:25:40
第一个问题应该是浓缩后蛋白达到一个过饱和状态，所以加入干扰会迅速沉淀。需要提高溶解度。
第二个问题可以，显示二硫键或半胱氨酸即可。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2012-05-03 01:45:23
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anzaigtt

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
donnafeng: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-05-03 08:25:55
1.浓度过高。本身蛋白的溶解度有限。
2.浓缩变性。离心的时候，蛋白质变性。
3.pymol看pdb
4. 不是仅仅加DTT与否的问题。
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6楼2012-05-03 07:51:21
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donnafeng

金虫 (小有名气)
第四个问题  是不是胞内酶都是没有二硫键的  以半胱氨酸的形式存在  有谁知道吗
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7楼2012-05-03 08:27:11
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sayaya

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
7楼: Originally posted by donnafeng at 2012-05-03 08:27:11:
第四个问题  是不是胞内酶都是没有二硫键的  以半胱氨酸的形式存在  有谁知道吗

当然不是。

二硫键是否形成取决于内、外部条件。
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8楼2012-05-03 10:34:11
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donnafeng

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by sayaya at 2012-05-03 10:34:11:
当然不是。

二硫键是否形成取决于内、外部条件。

<大肠杆菌二硫键形成相关蛋白的结构、功能及其在基因工程表达外源蛋白上的应用>张众黄华木梁
这篇文章里说“体内蛋白质二硫键的形成是在细胞中特定的部位完成
的。在大肠杆菌中，二硫键的形成一般仅限于细胞膜蛋白和
分泌蛋白［2］。大肠杆菌的胞质是一高度还原的环境，不包含
具有稳定二硫键的蛋白［5］。而且，许多胞质还原酶必须以巯
基为活性基团，所以胞质中存在特定的还原系统确保蛋白巯
基的还原状态［8-10］。高度氧化的大肠杆菌周质腔具有形成
二硫键所具备的一切条件，尤其是具有形成二硫键所必需的
酶类———Dsb蛋白，事实上，大肠杆菌蛋白质
二硫键的形成大多都是在周质腔完成的［11］。”    我的理解就是大肠杆菌胞质里的酶就是没有二硫键的 除非是膜蛋白或者分泌蛋白
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9楼2012-05-03 14:05:30
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月月大可

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+4, Good！ 2012-05-03 17:52:33
donnafeng: 金币+25, ★★★★★最佳答案 2012-05-03 19:47:02
浓度高了都会沉淀，有时候表象你看不出来，但是加入外力后瞬间表现。这可能是你吹打造成的，或者是蛋白已经过饱和，吹打后表现出来了。   可以考虑增加盐浓度，加入稳定剂，或者底物或者底物类似物。

pdb文件很多工具都可以打开，pymol， wincoot。后者我们解析结构时候多用。

没说二聚体是搞二硫键形成的吧，即使靠加入dtt或者β巯基乙醇也是可以的。二者在pH7-8之间的半衰期都很短，几十分钟到几小时。具体时间不记得了，自己查查吧，和温度 ph有密切关系。  他们在降解的过程中二硫键缓慢形成趋于稳定。

多数半胱氨酸都是游离形式的，形成二硫键的情况一般不多。
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10楼2012-05-03 16:10:40
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