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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 超滤浓缩后蛋白失去活性
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小李爱学习

银虫 (正式写手)

[求助] 超滤浓缩后蛋白失去活性

我是用ConA-Sepharose4B分离纯化的酶，
因为洗脱后酶液中含有较高浓度的Nacl（0.5 M）和甲基甘露糖苷（0.4 M）所以用超滤管进行了浓缩与缓冲液更换，结果酶活消失了。这个酶是蔗糖转化酶，具有一定比例的糖链。
具体操作是：
1、洗脱酶液用超滤管浓缩。
2、将浓缩酶液加入到新的超滤管，加0.05M Tris-Hcl 7.1的再进行超滤浓缩，这一步相当与将Nacl和甲基甘露糖苷稀释后又将酶进行浓缩。
3、结果再测酶活，发现没有活性了。
已经出现过两次这样的事情了！
我用超滤浓缩管原本是为了方便、快捷，没想到会有这样的情况，我每次都是用新的浓缩管，管子是密理博的，以前别的试验用过从没出现这种问题，我认为管子的质量是没问题的。
我认为有可能是超滤管上的膜把酶吸附了或者是有别的原因。我现在已经准备用透析了。
请各位大家帮忙分析下原因？或者有没有其他的更换缓冲液的方法和浓缩方法？
谢谢各位牛！
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1楼 2013-11-01 10:30:59
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gulpiye212

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

如果不是管子的问题，那极有可能是你用的缓冲液的pH不适合，使酶失活了~
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2楼2013-12-03 16:23:18
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小李爱学习

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gulpiye212 at 2013-12-03 16:23:18
如果不是管子的问题，那极有可能是你用的缓冲液的pH不适合，使酶失活了~

不会的，之前就是一直用这种缓冲液做的，不会有问题。
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3楼2013-12-03 17:00:24
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Allen206

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小李爱学习: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢你 2013-12-04 18:18:38
这还用说，当然脱盐柱啦，小样浓缩用PEG,
赞一下(1人) 回复此楼
不想说什么，，，，
4楼2013-12-04 13:16:09
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xissy

铜虫 (小有名气)
我的蛋白也是，利用超滤管浓缩蛋白和换buffer，结果活性丧失。
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5楼2015-02-11 10:58:17
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