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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 食品 » 粮油与蛋白 » 蛋白中巯基和二硫键的测定
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nisiying0701

木虫 (正式写手)

stan

[求助] 蛋白中巯基和二硫键的测定 已有2人参与

测定总巯基含量时，15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。测定自由巯基含量时，15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中，而后加入50 μL Ellman 试剂 （DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液，4 mg/mL），在25℃条件下保温反应60 min, 离心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 处测定吸光值，以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。
巯基含量的计算公式如下：
SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C
式中：A —除去试剂空白后样品的吸光度值
D—稀释倍数
C—样品浓度（mg/mL）

请教各位大神，这种方法中稀释倍数（D）和样品浓度（C）是多少？怎么得出的？万分感谢！！！！
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whatdoesn'tkillyoumakesyoustronger.
1楼 2014-07-10 00:28:05
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散仙孔乙己

新虫 (小有名气)
我想问一下你怎么测的二硫键，那个NTSB配的太麻烦了，有没有什么好的办法？
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5楼2014-11-10 19:34:05
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一点灵性

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

sytucom: 应助指数+1 2015-08-28 22:03:23
引用回帖:
5楼: Originally posted by 散仙孔乙己 at 2014-11-10 19:34:05
我想问一下你怎么测的二硫键，那个NTSB配的太麻烦了，有没有什么好的办法？

有，就是采用烷基化试剂碘代乙酰胺和碘代乙酸钠的试剂，在二者不同比例条件下可以打开不同的二硫键，然后在Native page gel上可以看到不同的band，从而定量。
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6楼2015-07-27 17:32:06
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缪缪喵喵喵

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 一点灵性 at 2015-07-27 17:32:06
有，就是采用烷基化试剂碘代乙酰胺和碘代乙酸钠的试剂，在二者不同比例条件下可以打开不同的二硫键，然后在Native page gel上可以看到不同的band，从而定量。...

你好，我正在找定量测蛋白质中二硫键的方法，能不能提供具体的一下。急用，万分感谢。
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10楼2016-01-10 16:25:55
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普通回帖

小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
nisiying0701: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-07-10 16:52:46
样品浓度C=样品的量（15mg）/溶液体积（5ml）=3mg/ml
稀释倍数D是自己定的，根据你的样品中巯基的含量不同合适的稀释倍数不同。就是3mg/ml的样品稀释D倍后，反应后测定得到的吸光值比较合适（一般0.2-0.8）。
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2楼2014-07-10 08:38:33
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nisiying0701

木虫 (正式写手)

stan
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-07-10 08:38:33
样品浓度C=样品的量（15mg）/溶液体积（5ml）=3mg/ml
稀释倍数D是自己定的，根据你的样品中巯基的含量不同合适的稀释倍数不同。就是3mg/ml的样品稀释D倍后，反应后测定得到的吸光值比较合适（一般0.2-0.8）。

如果按样品浓度3mg/ml正好合适，就不用稀释，即稀释倍数即为1是吗？
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whatdoesn'tkillyoumakesyoustronger.
3楼2014-07-10 16:54:55
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by nisiying0701 at 2014-07-10 16:54:55
如果按样品浓度3mg/ml正好合适，就不用稀释，即稀释倍数即为1是吗？...

对，是的。如果初始浓度合适，稀释倍数即为1。
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4楼2014-07-10 21:08:06
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1012203014

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 一点灵性 at 2015-07-27 17:32:06
有，就是采用烷基化试剂碘代乙酰胺和碘代乙酸钠的试剂，在二者不同比例条件下可以打开不同的二硫键，然后在Native page gel上可以看到不同的band，从而定量。...

您好，我最近也需要测这个你那有相关的文献，或者你是在北京吗？我去跟你学学谢谢
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奋斗！永不止步！
7楼2015-08-27 08:54:43
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1012203014

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-07-10 08:38:33
样品浓度C=样品的量（15mg）/溶液体积（5ml）=3mg/ml
稀释倍数D是自己定的，根据你的样品中巯基的含量不同合适的稀释倍数不同。就是3mg/ml的样品稀释D倍后，反应后测定得到的吸光值比较合适（一般0.2-0.8）。

测定总巯基含量时，15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。测定自由巯基含量时，15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中，而后加入50 μL Ellman 试剂 （DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液，4 mg/mL），在25℃条件下保温反应60 min, 离心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 处测定吸光值，以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。
巯基含量的计算公式如下：
SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C
式中：A —除去试剂空白后样品的吸光度值
D—稀释倍数
C—样品浓度（mg/mL）
问题1：上述公式中稀释倍数D是怎么算的（具体的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？
问题2：我测的物质为毛发固体样品，二硫键含量在350μmol/g附近，此种测试方法是否具有可行性
问题3：由于毛发样品中含有非水溶性蛋白，又没哟测量二硫键含量的更好的方法
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8楼2015-09-29 08:48:13
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1012203014

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 一点灵性 at 2015-07-27 17:32:06
有，就是采用烷基化试剂碘代乙酰胺和碘代乙酸钠的试剂，在二者不同比例条件下可以打开不同的二硫键，然后在Native page gel上可以看到不同的band，从而定量。...

测定总巯基含量时，15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。测定自由巯基含量时，15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中，而后加入50 μL Ellman 试剂 （DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液，4 mg/mL），在25℃条件下保温反应60 min, 离心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 处测定吸光值，以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。
巯基含量的计算公式如下：
SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C
式中：A —除去试剂空白后样品的吸光度值
D—稀释倍数
C—样品浓度（mg/mL）
问题1：上述公式中稀释倍数D是怎么算的（具体的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？
问题2：我测的物质为毛发固体样品，二硫键含量在350μmol/g附近，此种测试方法是否具有可行性
问题3：由于毛发样品中含有非水溶性蛋白，又没哟测量二硫键含量的更好的方法
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9楼2015-09-29 08:48:56
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