| 查看: 11033 | 回复: 25 | |||||||
| 本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||||||
[交流]
发现了beta actin作为内参的一个漏洞
|
|||||||
|
众所周知，β-actin作为基因定量或定性的内参，在PCR实验中有着广泛应用。但是小虫在对人β-actin（gene ID:60，以下简称ACTB）进行引物设计的时候，利用primer-blast对引物分析的时候发现引物除了能扩增出ACTB外，还能扩增出一个编码POTE锚蛋白域家族（gene ID：445582）的基因，于是小虫对俩基因进行了blast，结果发现ACTB cDNA全序列与POTE锚蛋白家族基因CDNA部分序列有着惊人的相似！下面是详细结果： 1.首先，ACTB和POTE锚蛋白基因ID不同，证明这完全是两个不同的基因  这是ACTB的ID  这是POTE的ID 2.其次，俩基因blast结果显示ACTB的全CDNA序列与POTE部分CDNA序列有着惊人的相似度  俩基因的blast结果 3.再次，正因为俩基因的相似，所以在对人ACTB进行引物设计的时候总是能扩增出POTE的部分片段，虽然扩增产物大小相同结构也极相似，但是由于他们是两个不同的基因，所以在已ACTB作为内参的时候实际上增加了初始模板量，这就不是对定量产生错误吗？  对我设计的人ACTB引物进行primer-blast结果，因为迫于保密，所以未上传我的引物序列 最后，基于我碰到的问题，有虫友能解释一下吗？同时因为这个问题如果得不到解释会对很多人的科研情况产生影响，所以建议版主将此帖强调一下，谢谢 [ Last edited by 孙启亮 on 2012-3-3 at 21:37 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 | 收藏 | 杂项 | 基因课表 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
» 猜你喜欢
HILIC磁珠研究蛋白组学怎么做？
已经有0人回复
-
His标签蛋白纯化怎么才能快？
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有288人回复
-
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析
已经有0人回复
-
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用
已经有0人回复
-
SHP2 变构抑制剂 Sitneprotafib：从作用机制到科研试剂选型要点
已经有0人回复
-
PRMT5·MTA 抑制剂 MRTX1719 的科研应用
已经有0人回复
-
SW033291 科研使用解析：分子特征、储存与实验获取要点
已经有0人回复
-
泛 RAS 抑制新思路：大环肽拟似物如何同时牵住突变型与野生型 RAS？
已经有0人回复
-
TYK2/JAK1 双靶点工具化合物 Brepocitinib：激酶选择性、研究进展与实验应用全解析
已经有0人回复
-
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质控实录：从一张HPLC图谱读懂纯度与稳定性
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 发现了一个问题
已经有5人回复
- 6-epi-beta-Cubebene中的epi是什么意思
已经有3人回复
- real-time PCR内参的问题
已经有8人回复
- western blot 内参β-actin图片异常
已经有11人回复
- F-actin与β-actin
已经有9人回复
- 基因/蛋白进化过程中的相关问题！！
已经有7人回复
- Actin（内参基因）为什么叫Actin
已经有6人回复
- western 内参beta-actin条带跑不出来
已经有17人回复
- 求助F-actin和β-actin的区别
已经有12人回复
- 进化树及序列上传相关问题
已经有9人回复
- 关节炎药未来市场：生物制剂唱主角
已经有4人回复
- 和一个美国生物方向faculty聊天.
已经有23人回复
- 做生物材料 RAFT试剂中二硫酯有毒性吗
已经有5人回复
- 电子科技大学生命科学与技术学院植物分子遗传课题组招收研究生调剂信息
已经有36人回复
- Fluent能不能实现按区域计算？把左边算出的速度场作为右边的入口条件？
已经有4人回复
- arcgis中地统计模块应用的问题，DEM怎么作为第二数据集输入呢？请高人指点
已经有3人回复
- ISSR分子标记,50个品种编号重整？
已经有6人回复
- 半定量内参条带的亮度不一样，各位大侠怎么办？？？急呀！！！！！
已经有22人回复
- puc19能作为表达载体用吗/
已经有8人回复
- -NCO含量的测定
已经有14人回复
- 【求助】各位从事生物医用高分子材料的大侠们快来看看呐！！
已经有10人回复
- 【求助/交流】RT-PCR ，内参在哪个步骤添加以及marker何时使用及确定？谢谢
已经有14人回复
- 【求助/交流】primer-blast
已经有3人回复
- 【求助】-NCO的检测问题？
已经有13人回复
- 【分享】2010年复旦大学植物分子生物学暑期学校招生通知
已经有14人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
2026年材料结构与力学性能国际会议（MSMP 2026
+1/993
-
2027年航天航空、材料与人工智能国际会议（AMAI 2027）
+1/883
-
2027年计算机视觉、设计与非遗文化传播国际会议（CVDC 2027）
+1/828
-
在上海找个一起打球的女朋友
+5/105
-
石河子大学能源与材料学院李航副教授课题组招收硕、博士
+1/99
-
东北师范大学诚招2027级博士研究生（双非生源优先考虑）
+1/96
-
石河子大学能源与材料学院李航副教授课题组招收硕、博士
+1/87
-
华南师范大学胡勇军教授课题组招收2027年推荐面试攻读研究生（推免生）
+1/51
-
韩国全北国立大学禽病研究所博士研究生招生简章
+2/48
-
重庆大学机械工程团队招收2027级全脱产工程博士
+1/30
-
半导体器件与能源催化—哈工大深圳校区红外薄膜与晶体团队招收博士后
+1/22
-
澳门大学光电方向招收博士研究生
+1/11
-
北航化学院彭勇教授招2027收硕士博士生
+1/11
-
废油资源化教育部工程中心 诚聘催化方向特聘研究员
+1/10
-
促炎VS修复」巨噬细胞的生存博弈：多种功能表型如何改写疾病结局？
+1/8
-
中山大学中山医学院(深圳校区)-肿瘤细胞生物课题组招收联培（客座）硕士/博士生
+1/6
-
国产CFD工业软件OpenFOAM、VirtualFlow：GPU加速与物理信息神经网络
+1/2
-
抗体在肿瘤信号通路机制研究与药物筛选中的具体应用
+1/2
-
海南大学“申请-考核”制博士研究生招生(第一批，2027年9月入学)
+1/2
-
秋季医学好刊，大量征稿
+1/1
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 回帖置顶 2012-03-31 16:56:49
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 学习了~ 2012-03-31 16:57:14
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 回帖置顶 2012-03-31 16:56:49
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 学习了~ 2012-03-31 16:57:14
| 常用看家基因，比如18s,gapdh, beta-actin等，并不一定适合用来做定量，已经有许多文章讨论这个问题了。在2003年左右芯片技术正红的时候，已经有文章探讨如何从芯片数据中挖掘更多的看家基因，这方面的文章许多发表在bmc molecular biology上，并且开发出了geNorm,NormFinder, BestKeeper等软件来评估最稳定最适合用来做QPCR reference的基因。当然，那些文章的出发点是常用看家基因在某些条件下并不稳定，或者存在paralog会导致不适合做reference。你这儿的发现可能与基因存在paralog的情况差不多，如果actin与pote相似性那么高，有可能是homolog，这种情况actin可能并不适合做定量的对照基因。 |
16楼2012-03-14 23:57:54
23楼2013-08-19 19:34:47
5楼2012-03-04 05:39:31
★ ★ ★ ★ ★
孙启亮(金币+1):谢谢参与
wanhscn(金币+4, 专家考核): 理解够全面深入，表示佩服！ 2012-03-05 20:23:52
孙启亮(金币+1):谢谢参与
wanhscn(金币+4, 专家考核): 理解够全面深入，表示佩服！ 2012-03-05 20:23:52
|
实际上很多的reference gene现在都被证明并不是万能的，因此，一般在选择内参的时候要选择在当前的条件下或者正在研究的细胞响应过程中是保持稳定的，这一点儿在细菌中非常常见。正因为如此，很多课题组现在都采用两个或者三个内参。 其次，nb在分析基因表达调控方面还是有着独特的优势的，因为不同mRNA的RT的差异非常非常大。 PS，真核生物的不了解，但是，多细胞生物中，不同细胞之间的转录水平也是有着相当惊人的差异的；因此，总RNA来源的数据，有的时候很难给一个合理的解释 |
6楼2012-03-04 09:37:28
8楼2012-03-04 10:16:38
17楼2012-03-15 08:19:13
2楼2012-03-03 21:39:59
3楼2012-03-03 21:41:53
4楼2012-03-04 01:58:11
7楼2012-03-04 10:11:01
10楼2012-03-04 16:26:22
11楼2012-03-06 09:15:44
13楼2012-03-06 17:05:38
★ ★
孙启亮(金币+1):谢谢参与
送鲜花一朵
孙启亮(金币+1): 谢谢参与讨论 2012-03-06 18:52:07
孙启亮(金币+1):谢谢参与
送鲜花一朵孙启亮(金币+1): 谢谢参与讨论 2012-03-06 18:52:07
|
本帖内容被屏蔽 |
14楼2012-03-06 18:45:04
15楼2012-03-14 11:45:22
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送鲜花一朵
西瓜: 金币+3, 鼓励交流 2012-03-31 16:57:57
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送鲜花一朵西瓜: 金币+3, 鼓励交流 2012-03-31 16:57:57
|
嗯........ 刚从qPCR的贴子转过来  这些实验都是针对Homo Sapiens的吗？我是做植物的，不是太了解 查了查资料，POTE蛋白的作用现在还是未知是吗，看到说其是在癌症细胞中才会存在，正常体内丰度很低？（不了解这个领域，不知这样说是否合适） 这个网站似乎只是从结构上推断了两者联系http://www.biograph.be/concept/graph/C1384510/C1837146 还有这么一篇文献： A primate-specific POTE-actin fusion protein plays a role in apoptosis 不知是否有何暗示呢.......对这个问题很感兴趣，但非相关专业很吃力，希望能看到楼主在这个问题上的进展  |
18楼2012-03-30 22:31:41
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+3, Can't agree more~ 2012-03-31 16:59:28
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+3, Can't agree more~ 2012-03-31 16:59:28
|
ACTB expression might be slightly increased in cancer cells. And for your question, i would recommend to check whether they are the same one but with different names. If not same, check about the mRNA expression of ACTB and POTE in cells. Last, you have some problem with your designed primers. PCR is very sensitive, once you design a specific primer against ACTB (100% complementary and control the length to make the primer is specifically designed)gene and well control of the PCR condition, there really should not have non specific amplification. |
19楼2012-03-31 12:54:25
20楼2012-03-31 13:11:16
21楼2012-04-01 18:04:24
22楼2012-04-01 19:27:53
24楼2013-08-20 02:59:35
25楼2014-12-25 23:30:37
26楼2014-12-26 16:14:26
简单回复
2012-03-04 14:52
回复
孙启亮(金币+1):谢谢参与
孙启亮12楼
2012-03-06 09:32
回复
