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孙启亮

金虫 (著名写手)

[交流] 发现了beta actin作为内参的一个漏洞

众所周知，β-actin作为基因定量或定性的内参，在PCR实验中有着广泛应用。但是小虫在对人β-actin（gene ID:60，以下简称ACTB）进行引物设计的时候，利用primer-blast对引物分析的时候发现引物除了能扩增出ACTB外，还能扩增出一个编码POTE锚蛋白域家族（gene ID：445582）的基因，于是小虫对俩基因进行了blast，结果发现ACTB cDNA全序列与POTE锚蛋白家族基因CDNA部分序列有着惊人的相似！下面是详细结果：
1.首先，ACTB和POTE锚蛋白基因ID不同，证明这完全是两个不同的基因

这是ACTB的ID

这是POTE的ID
2.其次，俩基因blast结果显示ACTB的全CDNA序列与POTE部分CDNA序列有着惊人的相似度

俩基因的blast结果
3.再次，正因为俩基因的相似，所以在对人ACTB进行引物设计的时候总是能扩增出POTE的部分片段，虽然扩增产物大小相同结构也极相似，但是由于他们是两个不同的基因，所以在已ACTB作为内参的时候实际上增加了初始模板量，这就不是对定量产生错误吗？

对我设计的人ACTB引物进行primer-blast结果，因为迫于保密，所以未上传我的引物序列

最后，基于我碰到的问题，有虫友能解释一下吗？同时因为这个问题如果得不到解释会对很多人的科研情况产生影响，所以建议版主将此帖强调一下，谢谢

[ Last edited by 孙启亮 on 2012-3-3 at 21:37 ]

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1楼 2012-03-03 21:24:53

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tianping

木虫 (小有名气)

MolEPI: 1
应助: 0 (幼儿园)
金币: 1643.6
帖子: 175
在线: 85.5小时
虫号: 259283

★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 回帖置顶 2012-03-31 16:56:49
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 学习了~ 2012-03-31 16:57:14

常用看家基因，比如18s,gapdh, beta-actin等，并不一定适合用来做定量，已经有许多文章讨论这个问题了。在2003年左右芯片技术正红的时候，已经有文章探讨如何从芯片数据中挖掘更多的看家基因，这方面的文章许多发表在bmc molecular biology上，并且开发出了geNorm,NormFinder, BestKeeper等软件来评估最稳定最适合用来做QPCR reference的基因。当然，那些文章的出发点是常用看家基因在某些条件下并不稳定，或者存在paralog会导致不适合做reference。你这儿的发现可能与基因存在paralog的情况差不多，如果actin与pote相似性那么高，有可能是homolog，这种情况actin可能并不适合做定量的对照基因。

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