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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 发现了beta actin作为内参的一个漏洞
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孙启亮

金虫 (著名写手)

[交流] 发现了beta actin作为内参的一个漏洞

众所周知，β-actin作为基因定量或定性的内参，在PCR实验中有着广泛应用。但是小虫在对人β-actin（gene ID:60，以下简称ACTB）进行引物设计的时候，利用primer-blast对引物分析的时候发现引物除了能扩增出ACTB外，还能扩增出一个编码POTE锚蛋白域家族（gene ID：445582）的基因，于是小虫对俩基因进行了blast，结果发现ACTB cDNA全序列与POTE锚蛋白家族基因CDNA部分序列有着惊人的相似！下面是详细结果：
    1.首先，ACTB和POTE锚蛋白基因ID不同，证明这完全是两个不同的基因

这是ACTB的ID



这是POTE的ID
    2.其次，俩基因blast结果显示ACTB的全CDNA序列与POTE部分CDNA序列有着惊人的相似度

俩基因的blast结果
   3.再次，正因为俩基因的相似，所以在对人ACTB进行引物设计的时候总是能扩增出POTE的部分片段，虽然扩增产物大小相同结构也极相似，但是由于他们是两个不同的基因，所以在已ACTB作为内参的时候实际上增加了初始模板量，这就不是对定量产生错误吗？

对我设计的人ACTB引物进行primer-blast结果，因为迫于保密，所以未上传我的引物序列


最后，基于我碰到的问题，有虫友能解释一下吗？同时因为这个问题如果得不到解释会对很多人的科研情况产生影响，所以建议版主将此帖强调一下，谢谢

[ Last edited by 孙启亮 on 2012-3-3 at 21:37 ]
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1楼 2012-03-03 21:24:53
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孙启亮

金虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by cindybrella at 2012-03-03 21:39:59:
啊啊啊？

以上有我提供的俩基因ID，有兴趣的话可以自己操作一下，期望与你深度交流
赞一下 回复此楼
3楼2012-03-03 21:41:53
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xsm918

铁虫 (小有名气)
★
孙启亮(金币+1):谢谢参与
你设计的引物还不够特异！
赞一下 回复此楼
4楼2012-03-04 01:58:11
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exon2002

铁杆木虫 (著名写手)
★
孙启亮(金币+1):谢谢参与
对楼主的细心表示很敬佩！这确实是一个问题了。我的看法有二，其一是要查一下POTE与b-actin的关系，二者是否有生物学同源性。来自于同一个基因或进化上的部分保留的情况常见。甚至在翻译后做了某种修饰就成了另外一种蛋白去行使不同或相似的功能的情况也常见。其二，即使两个蛋白的序列及其相似，使得我们的内参不如以前想象的那么清晰，但是以总体作为内参也有效，只是其真正的来源不明朗而已。这个疑问可以通过基因表达调查而澄清。所以用b-actin做内参的同仁不必惊慌。
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5楼2012-03-04 05:39:31
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quiller2000

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
孙启亮(金币+1):谢谢参与
wanhscn(金币+4, 专家考核): 理解够全面深入，表示佩服！ 2012-03-05 20:23:52
实际上很多的reference gene现在都被证明并不是万能的，因此，一般在选择内参的时候要选择在当前的条件下或者正在研究的细胞响应过程中是保持稳定的，这一点儿在细菌中非常常见。正因为如此，很多课题组现在都采用两个或者三个内参。
其次，nb在分析基因表达调控方面还是有着独特的优势的，因为不同mRNA的RT的差异非常非常大。

PS，真核生物的不了解，但是，多细胞生物中，不同细胞之间的转录水平也是有着相当惊人的差异的；因此，总RNA来源的数据，有的时候很难给一个合理的解释
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6楼2012-03-04 09:37:28
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dongfang129楼
2012-03-04 14:52   回复  
孙启亮(金币+1):谢谢参与
孙启亮12楼
2012-03-06 09:32   回复  
引用回帖:
11楼: Originally posted by 斯多格格 at 2012-03-06 09:15:44: 这个未免牵强了吧？

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