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发现了beta actin作为内参的一个漏洞
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众所周知，β-actin作为基因定量或定性的内参，在PCR实验中有着广泛应用。但是小虫在对人β-actin（gene ID:60，以下简称ACTB）进行引物设计的时候，利用primer-blast对引物分析的时候发现引物除了能扩增出ACTB外，还能扩增出一个编码POTE锚蛋白域家族（gene ID：445582）的基因，于是小虫对俩基因进行了blast，结果发现ACTB cDNA全序列与POTE锚蛋白家族基因CDNA部分序列有着惊人的相似！下面是详细结果： 1.首先，ACTB和POTE锚蛋白基因ID不同，证明这完全是两个不同的基因  这是ACTB的ID  这是POTE的ID 2.其次，俩基因blast结果显示ACTB的全CDNA序列与POTE部分CDNA序列有着惊人的相似度  俩基因的blast结果 3.再次，正因为俩基因的相似，所以在对人ACTB进行引物设计的时候总是能扩增出POTE的部分片段，虽然扩增产物大小相同结构也极相似，但是由于他们是两个不同的基因，所以在已ACTB作为内参的时候实际上增加了初始模板量，这就不是对定量产生错误吗？  对我设计的人ACTB引物进行primer-blast结果，因为迫于保密，所以未上传我的引物序列 最后，基于我碰到的问题，有虫友能解释一下吗？同时因为这个问题如果得不到解释会对很多人的科研情况产生影响，所以建议版主将此帖强调一下，谢谢 [ Last edited by 孙启亮 on 2012-3-3 at 21:37 ] |
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孙启亮(金币+1):谢谢参与
wanhscn(金币+4, 专家考核): 理解够全面深入，表示佩服！ 2012-03-05 20:23:52
孙启亮(金币+1):谢谢参与
wanhscn(金币+4, 专家考核): 理解够全面深入，表示佩服！ 2012-03-05 20:23:52
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实际上很多的reference gene现在都被证明并不是万能的，因此，一般在选择内参的时候要选择在当前的条件下或者正在研究的细胞响应过程中是保持稳定的，这一点儿在细菌中非常常见。正因为如此，很多课题组现在都采用两个或者三个内参。 其次，nb在分析基因表达调控方面还是有着独特的优势的，因为不同mRNA的RT的差异非常非常大。 PS，真核生物的不了解，但是，多细胞生物中，不同细胞之间的转录水平也是有着相当惊人的差异的；因此，总RNA来源的数据，有的时候很难给一个合理的解释 |
6楼2012-03-04 09:37:28
简单回复
2012-03-04 14:52
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孙启亮(金币+1):谢谢参与
孙启亮12楼
2012-03-06 09:32
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