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发现了beta actin作为内参的一个漏洞
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众所周知，β-actin作为基因定量或定性的内参，在PCR实验中有着广泛应用。但是小虫在对人β-actin（gene ID:60，以下简称ACTB）进行引物设计的时候，利用primer-blast对引物分析的时候发现引物除了能扩增出ACTB外，还能扩增出一个编码POTE锚蛋白域家族（gene ID：445582）的基因，于是小虫对俩基因进行了blast，结果发现ACTB cDNA全序列与POTE锚蛋白家族基因CDNA部分序列有着惊人的相似！下面是详细结果： 1.首先，ACTB和POTE锚蛋白基因ID不同，证明这完全是两个不同的基因  这是ACTB的ID  这是POTE的ID 2.其次，俩基因blast结果显示ACTB的全CDNA序列与POTE部分CDNA序列有着惊人的相似度  俩基因的blast结果 3.再次，正因为俩基因的相似，所以在对人ACTB进行引物设计的时候总是能扩增出POTE的部分片段，虽然扩增产物大小相同结构也极相似，但是由于他们是两个不同的基因，所以在已ACTB作为内参的时候实际上增加了初始模板量，这就不是对定量产生错误吗？  对我设计的人ACTB引物进行primer-blast结果，因为迫于保密，所以未上传我的引物序列 最后，基于我碰到的问题，有虫友能解释一下吗？同时因为这个问题如果得不到解释会对很多人的科研情况产生影响，所以建议版主将此帖强调一下，谢谢 [ Last edited by 孙启亮 on 2012-3-3 at 21:37 ] |
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小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 回帖置顶 2012-03-31 16:56:49
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 学习了~ 2012-03-31 16:57:14
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 回帖置顶 2012-03-31 16:56:49
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 学习了~ 2012-03-31 16:57:14
| 常用看家基因，比如18s,gapdh, beta-actin等，并不一定适合用来做定量，已经有许多文章讨论这个问题了。在2003年左右芯片技术正红的时候，已经有文章探讨如何从芯片数据中挖掘更多的看家基因，这方面的文章许多发表在bmc molecular biology上，并且开发出了geNorm,NormFinder, BestKeeper等软件来评估最稳定最适合用来做QPCR reference的基因。当然，那些文章的出发点是常用看家基因在某些条件下并不稳定，或者存在paralog会导致不适合做reference。你这儿的发现可能与基因存在paralog的情况差不多，如果actin与pote相似性那么高，有可能是homolog，这种情况actin可能并不适合做定量的对照基因。 |
16楼2012-03-14 23:57:54
23楼2013-08-19 19:34:47
5楼2012-03-04 05:39:31
★ ★ ★ ★ ★
孙启亮(金币+1):谢谢参与
wanhscn(金币+4, 专家考核): 理解够全面深入，表示佩服！ 2012-03-05 20:23:52
孙启亮(金币+1):谢谢参与
wanhscn(金币+4, 专家考核): 理解够全面深入，表示佩服！ 2012-03-05 20:23:52
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实际上很多的reference gene现在都被证明并不是万能的，因此，一般在选择内参的时候要选择在当前的条件下或者正在研究的细胞响应过程中是保持稳定的，这一点儿在细菌中非常常见。正因为如此，很多课题组现在都采用两个或者三个内参。 其次，nb在分析基因表达调控方面还是有着独特的优势的，因为不同mRNA的RT的差异非常非常大。 PS，真核生物的不了解，但是，多细胞生物中，不同细胞之间的转录水平也是有着相当惊人的差异的；因此，总RNA来源的数据，有的时候很难给一个合理的解释 |
6楼2012-03-04 09:37:28
8楼2012-03-04 10:16:38
17楼2012-03-15 08:19:13
2楼2012-03-03 21:39:59
3楼2012-03-03 21:41:53
4楼2012-03-04 01:58:11
7楼2012-03-04 10:11:01
10楼2012-03-04 16:26:22
11楼2012-03-06 09:15:44
13楼2012-03-06 17:05:38
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孙启亮(金币+1):谢谢参与
送鲜花一朵
孙启亮(金币+1): 谢谢参与讨论 2012-03-06 18:52:07
孙启亮(金币+1):谢谢参与
送鲜花一朵孙启亮(金币+1): 谢谢参与讨论 2012-03-06 18:52:07
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本帖内容被屏蔽 |
14楼2012-03-06 18:45:04
15楼2012-03-14 11:45:22
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送鲜花一朵
西瓜: 金币+3, 鼓励交流 2012-03-31 16:57:57
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送鲜花一朵西瓜: 金币+3, 鼓励交流 2012-03-31 16:57:57
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嗯........ 刚从qPCR的贴子转过来  这些实验都是针对Homo Sapiens的吗？我是做植物的，不是太了解 查了查资料，POTE蛋白的作用现在还是未知是吗，看到说其是在癌症细胞中才会存在，正常体内丰度很低？（不了解这个领域，不知这样说是否合适） 这个网站似乎只是从结构上推断了两者联系http://www.biograph.be/concept/graph/C1384510/C1837146 还有这么一篇文献： A primate-specific POTE-actin fusion protein plays a role in apoptosis 不知是否有何暗示呢.......对这个问题很感兴趣，但非相关专业很吃力，希望能看到楼主在这个问题上的进展  |
18楼2012-03-30 22:31:41
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+3, Can't agree more~ 2012-03-31 16:59:28
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+3, Can't agree more~ 2012-03-31 16:59:28
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ACTB expression might be slightly increased in cancer cells. And for your question, i would recommend to check whether they are the same one but with different names. If not same, check about the mRNA expression of ACTB and POTE in cells. Last, you have some problem with your designed primers. PCR is very sensitive, once you design a specific primer against ACTB (100% complementary and control the length to make the primer is specifically designed)gene and well control of the PCR condition, there really should not have non specific amplification. |
19楼2012-03-31 12:54:25
20楼2012-03-31 13:11:16
21楼2012-04-01 18:04:24
22楼2012-04-01 19:27:53
24楼2013-08-20 02:59:35
25楼2014-12-25 23:30:37
26楼2014-12-26 16:14:26
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2012-03-04 14:52
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孙启亮(金币+1):谢谢参与
孙启亮12楼
2012-03-06 09:32
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