[求助] 点突变pcr后跑琼脂糖凝胶电泳发现条带不对，请高手指点！！！

本人想把一个质粒（7.8kbp）中的一个氨基酸变成另一个氨基酸，因此有连续三个点要突变。

选择使用的方法是合成两个反向互补的包含突变位点的引物，GC%=60% Tm=86.8如下：
F： CACAGTCTGGGGCATCGATCAGCTCCAGGCAAGAG
R：CTCTTGCCTGGAGCTGATCGATGCCCCAGACTGTG

用Fermentas的Premix PrimeSTAR 进行PCR 98℃ 1min 1cycle；98℃ 10sec， 55℃ 5sec，72℃ 8min 24cycle；72℃ 10min 1cycle

PCR后进行电泳第一泳道为maker 第二泳道为不加引物做的PCR 最后一个泳道为模板质粒中间的都是不同浓度的模板和引物做的PCR产物可见PCR产物最亮的条带与模板质粒位置相差很大

将PCR产物用DpnI酶切后模板切掉；再进行转化，发现LB平板上有两种克隆，一种是很大很亮的单克隆，但在它们旁边还有许多星星点点的小克隆

求助！求高手！请问这是怎么回事？出现什么问题了吗？

之前实验室有人用相同方法做不同的质粒是可以成功的

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1楼 2012-02-17 17:51:22

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todouhy

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【答案】应助回帖

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你好，我也是做突变的，用的酶也是prime STAR酶，你跑胶的质粒是超螺旋的，而pcr产物是线性的，这个不好对照。按照这个酶推荐的程序，我会这样设计：98℃ 3min 1cycle；98℃ 10sec， 60-68℃10sec，72℃ 8min 30cycles；72℃ 10min 1cycle，引物设计的话你们实验室也做了估计不会错的，有经验了嘛，针对这个“将PCR产物用DpnI酶切后模板切掉；再进行转化，发现LB平板上有两种克隆，一种是很大很亮的单克隆，但在它们旁边还有许多星星点点的小克隆”，首先消化一定要完全，不然原始质粒会影响实验结果，还有就是转化后培养时间是不是超过16小时，这样会长出卫星菌落。如果长出来的菌很大很大喝以前转化不同的话估计就是感受态染菌了。

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