[求助] 点突变pcr后跑琼脂糖凝胶电泳发现条带不对，请高手指点！！！

本人想把一个质粒（7.8kbp）中的一个氨基酸变成另一个氨基酸，因此有连续三个点要突变。

选择使用的方法是合成两个反向互补的包含突变位点的引物，GC%=60% Tm=86.8如下：
F： CACAGTCTGGGGCATCGATCAGCTCCAGGCAAGAG
R：CTCTTGCCTGGAGCTGATCGATGCCCCAGACTGTG

用Fermentas的Premix PrimeSTAR 进行PCR 98℃ 1min 1cycle；98℃ 10sec， 55℃ 5sec，72℃ 8min 24cycle；72℃ 10min 1cycle

PCR后进行电泳第一泳道为maker 第二泳道为不加引物做的PCR 最后一个泳道为模板质粒中间的都是不同浓度的模板和引物做的PCR产物可见PCR产物最亮的条带与模板质粒位置相差很大

将PCR产物用DpnI酶切后模板切掉；再进行转化，发现LB平板上有两种克隆，一种是很大很亮的单克隆，但在它们旁边还有许多星星点点的小克隆

求助！求高手！请问这是怎么回事？出现什么问题了吗？

之前实验室有人用相同方法做不同的质粒是可以成功的

回复此楼

» 猜你喜欢

售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急已经有3人回复
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急已经有4人回复
售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急已经有3人回复
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急已经有4人回复
售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急已经有4人回复
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急已经有7人回复
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急已经有10人回复
售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急已经有7人回复
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急已经有6人回复
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急已经有8人回复

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，泳道很亮是什么原因？已经有28人回复
ＰＣＲ产物跑电泳，随着跑电泳时间的增加，，条带会下移，最后竟然消失了，怎么回事呀已经有25人回复
为什么PCR之后的电泳会出现这样的条带？图片不太清楚，左边三条是内参已经有9人回复
琼脂糖凝胶电泳：同一批样每次结果不一致，为什么?_? 已经有10人回复
电泳图中出现的杂带是什么原因已经有10人回复
同样的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳时而有带时而没带，但marker每次都清晰已经有18人回复
PCR后琼脂糖凝胶电泳条带不直已经有14人回复
跑PCR，琼脂糖电泳没有条带出现已经有14人回复
急！各位帮忙看看，PCR后跑的琼脂糖凝胶电泳图，条带不清晰原因是什么？已经有16人回复
提取DNA后，PCR电泳无条带已经有5人回复
琼脂糖凝胶电泳出现严重的拖带已经有10人回复
请教基因载体跑琼脂糖凝胶电泳的结果无条带问题已经有11人回复
琼脂糖凝胶电泳后发现目的条带偏大是什么原因已经有6人回复
琼脂糖凝胶电泳跑成这样是什么原因？已经有11人回复
琼脂糖凝胶电泳时，只有泳道两边发亮，中间没有条带已经有9人回复
琼脂糖凝胶电泳已经有20人回复
琼脂糖凝胶电泳结果已经有6人回复
琼脂糖凝胶电泳，跑的条带有点难看已经有15人回复
PCR后电泳条带异常已经有10人回复
PCR后凝胶电泳条带时有时无是怎么回事？已经有5人回复
【求助/交流】急！！！琼脂糖凝胶电泳的问题，跑不出条带了！！已经有8人回复
【求助/交流】提取基因组DNA后琼脂糖凝胶电泳显示拖尾已经有12人回复
【求助/交流】pcr结果电泳条带很淡已经有14人回复
【求助/交流】PCR后电泳出现两条带是怎么回事？已经有10人回复
【求助/交流】琼脂糖电泳条带不亮的原因已经有16人回复

1楼 2012-02-17 17:51:22

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

todouhy

铜虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 124
帖子: 107
在线: 10.2小时
虫号: 906434
注册: 2009-11-18
专业: 蛋白质组学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

你好，我也是做突变的，用的酶也是prime STAR酶，你跑胶的质粒是超螺旋的，而pcr产物是线性的，这个不好对照。按照这个酶推荐的程序，我会这样设计：98℃ 3min 1cycle；98℃ 10sec， 60-68℃10sec，72℃ 8min 30cycles；72℃ 10min 1cycle，引物设计的话你们实验室也做了估计不会错的，有经验了嘛，针对这个“将PCR产物用DpnI酶切后模板切掉；再进行转化，发现LB平板上有两种克隆，一种是很大很亮的单克隆，但在它们旁边还有许多星星点点的小克隆”，首先消化一定要完全，不然原始质粒会影响实验结果，还有就是转化后培养时间是不是超过16小时，这样会长出卫星菌落。如果长出来的菌很大很大喝以前转化不同的话估计就是感受态染菌了。

赞一下