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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒测序正确，蛋白无法表达
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蓝色基因

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】质粒测序正确，蛋白无法表达

要表达一个蛋白，根据已知的全基因组设计了相关引物，PCR,酶切，连接，转化一步步做下来。最后双酶切之后选取质粒进行测序后发现正是自己想要的那个片段。

但是蛋白无法表达，重新进行电转了BL21和MC4100菌株，但还是不行。

请问大家有什么好的解决方法？
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1楼2010-11-16 12:14:15
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
★
lstt09nk(金币+1):感谢交流 2010-11-16 12:52:42
蓝色基因(金币+2):感谢。 2010-11-16 23:57:20
电转转进去了吗，做过检测了吗？
要是转进去了，但是没表达的话
可能是要优化一下诱导条件了
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2楼2010-11-16 12:51:45
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蓝色基因

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by jhu132llh at 2010-11-16 12:51:45:
电转转进去了吗，做过检测了吗？
要是转进去了，但是没表达的话
可能是要优化一下诱导条件了

电转之后平板也长出来了啊，难道还需要提取质粒测序……？
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3楼2010-11-16 13:40:12
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xinyaolu

木虫 (小有名气)
蓝色基因(金币+2):谢谢。 2010-11-16 23:57:43
引用回帖:
Originally posted by 蓝色基因 at 2010-11-16 13:40:12:


电转之后平板也长出来了啊，难道还需要提取质粒测序……？

转化质粒应该没有问题。确定读码框没有错误，分析一下稀有密码子，如果比较多，可以尝试rosetta（DE3）。如果还是没有表达，可能是基因本身的问题。RNA3’的特殊结构可能导致转录出现问题，这种情况可以尝试融合表达，譬如pET-32a。
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4楼2010-11-16 14:47:11
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hkfgwww

银虫 (正式写手)
蓝色基因(金币+2):谢谢。 2010-11-16 23:57:56
我第一次也没有表达，重新转化后表达了。
个人觉得可以降低温度诱导。

另外，也许是表达量太低，也可以试一下western blot，定性的检测一下。
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5楼2010-11-16 16:21:45
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375050424

银虫 (小有名气)
蓝色基因(金币+2):谢谢。 2010-11-16 23:58:09
先确定自己连的片段有没有移码，是不是又很多稀有密码子。确定没问题的话，换个条件试试，（温度，IPTG）
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6楼2010-11-16 16:49:39
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