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蓝色基因

金虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】质粒测序正确,蛋白无法表达

要表达一个蛋白,根据已知的全基因组设计了相关引物,PCR,酶切,连接,转化一步步做下来。最后双酶切之后选取质粒进行测序后发现正是自己想要的那个片段。

但是蛋白无法表达,重新进行电转了BL21和MC4100菌株,但还是不行。

请问大家有什么好的解决方法?
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xinyaolu

木虫 (小有名气)


蓝色基因(金币+2):谢谢。 2010-11-16 23:57:43
引用回帖:
Originally posted by 蓝色基因 at 2010-11-16 13:40:12:


电转之后平板也长出来了啊,难道还需要提取质粒测序……?

转化质粒应该没有问题。确定读码框没有错误,分析一下稀有密码子,如果比较多,可以尝试rosetta(DE3)。如果还是没有表达,可能是基因本身的问题。RNA3’的特殊结构可能导致转录出现问题,这种情况可以尝试融合表达,譬如pET-32a。
4楼2010-11-16 14:47:11
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lstt09nk(金币+1):感谢交流 2010-11-16 12:52:42
蓝色基因(金币+2):感谢。 2010-11-16 23:57:20
电转转进去了吗,做过检测了吗?
要是转进去了,但是没表达的话
可能是要优化一下诱导条件了
2楼2010-11-16 12:51:45
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蓝色基因

金虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by jhu132llh at 2010-11-16 12:51:45:
电转转进去了吗,做过检测了吗?
要是转进去了,但是没表达的话
可能是要优化一下诱导条件了

电转之后平板也长出来了啊,难道还需要提取质粒测序……?
3楼2010-11-16 13:40:12
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hkfgwww

银虫 (正式写手)


蓝色基因(金币+2):谢谢。 2010-11-16 23:57:56
我第一次也没有表达,重新转化后表达了。
个人觉得可以降低温度诱导。

另外,也许是表达量太低,也可以试一下western blot,定性的检测一下。
5楼2010-11-16 16:21:45
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