应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR遇挫！求解决之道！
141/2返回列表12下一页
查看: 1084  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

feiye2214

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR遇挫！求解决之道！ 已有9人参与

小弟想扩增一段已知序列，
5’tttgatgaaaatcgctt......aggcct...tcaaaaacact......tctcttttacagttcagcc3’.....1609bp
                                                                       3’agaaaatgtcaagtcgg5’
现在我就把上下游的17个序列作为引物序列，并加上限制酶切位点序列设计引物为：
Pf：5’GGCGAATTCGtttgatgaaaatcgctt3’
Pr：5’ ATTGGATCCggctgaactgtaaaaga3’
去扩增该序列时，跑胶看到四条明显的条带，1000-1500bp有两条，750bp之下还有两条，我要的片段是1609bp的，我该如何获得目的片段？

是否把每条带都切下来送去测序哦？
还是调整引物和PCR条件再次实验？能不能在再延长引物序列以增加特异性，本来有27个了，听说最长可以达到35bp？是否可行？
时间紧迫，跪求答案！
这段片段是想做克隆的。

[ Last edited by feiye2214 on 2010-7-23 at 17:59 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-07-23 16:17:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~！
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1):欢迎交流！ 2010-07-23 18:16:40
我认为你可以把1000-1500的两条带切下来，纯化，做克隆试试啊……这是最省时间 的，还有，把你设计的引物放入NCBI，BLAST一下，看看是不是你对应的物种的相应序列
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2010-07-23 16:28:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
还是应该引物有点不太合适，重新设计两条引物吧
赞一下 回复此楼
我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
3楼2010-07-23 17:40:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

feiye2214

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-07-23 17:40:17:
还是应该引物有点不太合适，重新设计两条引物吧

我的引物已经是27bp了，能不能再延长一点以增加特异性啊？？
赞一下 回复此楼
4楼2010-07-23 17:51:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~！
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
27bp已经蛮长了啊，要不试试梯度PCR，摸摸条件？
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2010-07-23 18:18:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

feiye2214

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xp198766 at 2010-07-23 18:18:32:
27bp已经蛮长了啊，要不试试梯度PCR，摸摸条件？

我一开始就做的梯度，退火温度和镁离子，45度的退火温度是不是太低？
但是在45度才有条带，我做到了65度，其他温度范围没有条带
赞一下 回复此楼
6楼2010-07-23 19:35:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~！
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
有带的话，切胶克隆也蛮容易的啊，就两条带切嘛，要不也许还要重新设计引物之类的，时间更久呢
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2010-07-23 19:45:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lgslgwlgs

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking:严禁纯表情发帖。 2010-07-23 22:15:44
8楼2010-07-23 19:51:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

louli

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引物的问题 特异性不强  换一个引物吧
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2010-07-23 19:51:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lgslgwlgs

木虫 (小有名气)
我也想知道
回复此楼
10楼2010-07-23 19:52:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 feiye2214 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 4/200 2026-09-14 17:48 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 4/200 2026-09-14 17:25 by Aj1rhIDL5ixY
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 5/250 2026-09-14 16:25 by Aj1rhIDL5ixY
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:13 by Aj1rhIDL5ixY
[考研] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:12 by Aj1rhIDL5ixY
[找工作] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:00 by Aj1rhIDL5ixY
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:57 by Aj1rhIDL5ixY
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:48 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:37 by Aj1rhIDL5ixY
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 6/300 2026-09-14 15:21 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:13 by Aj1rhIDL5ixY
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 3/150 2026-09-14 15:09 by Aj1rhIDL5ixY
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 6/300 2026-09-14 15:00 by Aj1rhIDL5ixY
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 3/150 2026-09-14 14:57 by Aj1rhIDL5ixY
[找工作] 浙江师范大学是怎么坑我的 +6 recruit123 2026-09-09 6/300 2026-09-14 12:00 by 萨仁其其格
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 3/150 2026-09-14 10:11 by 23jxep3nCNZb
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 4/200 2026-09-14 10:01 by 23jxep3nCNZb
[考博] 27秋季材料博士申请求助 10+3 Cahal1 2026-09-11 4/200 2026-09-14 08:50 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 面上有专家说实验设备不是我们单位的 +6 zj_muchong 2026-09-08 8/400 2026-09-11 06:56 by suifengdao
[有机交流] 科研求助 10+4 我吃一只鱼 2026-09-07 4/200 2026-09-10 08:32 by 0940628
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭