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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR遇挫！求解决之道！
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feiye2214

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR遇挫！求解决之道！ 已有9人参与

小弟想扩增一段已知序列，
5’tttgatgaaaatcgctt......aggcct...tcaaaaacact......tctcttttacagttcagcc3’.....1609bp
                                                                       3’agaaaatgtcaagtcgg5’
现在我就把上下游的17个序列作为引物序列，并加上限制酶切位点序列设计引物为：
Pf：5’GGCGAATTCGtttgatgaaaatcgctt3’
Pr：5’ ATTGGATCCggctgaactgtaaaaga3’
去扩增该序列时，跑胶看到四条明显的条带，1000-1500bp有两条，750bp之下还有两条，我要的片段是1609bp的，我该如何获得目的片段？

是否把每条带都切下来送去测序哦？
还是调整引物和PCR条件再次实验？能不能在再延长引物序列以增加特异性，本来有27个了，听说最长可以达到35bp？是否可行？
时间紧迫，跪求答案！
这段片段是想做克隆的。

[ Last edited by feiye2214 on 2010-7-23 at 17:59 ]
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1楼 2010-07-23 16:17:56
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xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~！
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1):欢迎交流！ 2010-07-23 18:16:40
我认为你可以把1000-1500的两条带切下来，纯化，做克隆试试啊……这是最省时间 的，还有，把你设计的引物放入NCBI，BLAST一下，看看是不是你对应的物种的相应序列
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2楼2010-07-23 16:28:30
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
还是应该引物有点不太合适，重新设计两条引物吧
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
3楼2010-07-23 17:40:17
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feiye2214

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-07-23 17:40:17:
还是应该引物有点不太合适，重新设计两条引物吧

我的引物已经是27bp了，能不能再延长一点以增加特异性啊？？
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4楼2010-07-23 17:51:57
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xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~！
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
27bp已经蛮长了啊，要不试试梯度PCR，摸摸条件？
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5楼2010-07-23 18:18:32
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feiye2214

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xp198766 at 2010-07-23 18:18:32:
27bp已经蛮长了啊，要不试试梯度PCR，摸摸条件？

我一开始就做的梯度，退火温度和镁离子，45度的退火温度是不是太低？
但是在45度才有条带，我做到了65度，其他温度范围没有条带
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6楼2010-07-23 19:35:49
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xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~！
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
有带的话，切胶克隆也蛮容易的啊，就两条带切嘛，要不也许还要重新设计引物之类的，时间更久呢
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7楼2010-07-23 19:45:25
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lgslgwlgs

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking:严禁纯表情发帖。 2010-07-23 22:15:44
8楼2010-07-23 19:51:34
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louli

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引物的问题 特异性不强  换一个引物吧
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9楼2010-07-23 19:51:57
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lgslgwlgs

木虫 (小有名气)
我也想知道
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10楼2010-07-23 19:52:03
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