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PCR产物做酶切 已有2人参与
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PCR产物片段大小是745bp，要做的是通过酶切分基因型，不同的酶切结果对应不同的基因型。酶切后共有三种基因型，第一种是酶切后两条带，528和217；第二种是三条带，745，528和217；第三种是一条带，745。现在酶切结果最多的时候能出现五条带，分别在1000左右、745、528、500左右、217。用的酶是thermo的Apa I.PCR体系是15微升，之后直接加0.5微升的酶和1微升的buffer,酶切3小时。哪位大神能赐教一下这是怎么个情况？之前做的都没有出现这种情况，酶切之后条带怎么会变大呢？？ 发自小木虫Android客户端 |
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2楼2016-05-09 16:38:10
3楼2016-05-09 17:56:21
4楼2016-05-09 18:20:34
yesucao
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5楼2016-05-09 19:51:21
6楼2016-05-09 22:30:40
jackyoung
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以后遇到这种酶切问题直接将PCR产物稀释两倍进行酶切，即内切酶+buffer+水配2X mix，一般可以保证排除PCR产物影响酶切的可能。酶切时间稍微控制一下，比如1hr（好像ApaI易失活，多了也没用，半衰期30min ??），至于结果，在有干扰的条件下你只需要关注特异条带即可，比如亲本带型中特异的条带分别为217/500+, 745单条带，和杂合带型。 发自小木虫Android客户端 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
7楼2016-05-10 00:15:38
送红花一朵 |
左边图片是PCR产物7.5微升加水7.5微升混匀，加0.5微升 Apa I，1微升 buffer酶切。四个样一组，共16个不同的样品。酶切时间从左到右依次1H，1.5H，2H，2.5H。右边图片是别人做的，就按照右图进行分型。我想问一下，酶切时间多久比较合适？怎么确定酶切是否完全呢？（GG型如果没有酶切完全的话是三条带，酶切完全的GT也是三条带）   发自小木虫Android客户端 |
8楼2016-05-11 17:37:26
wodejiapple
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9楼2016-05-12 08:47:13
jackyoung
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如果最终体系是15ul，PCR产物加7.5微升的话，酶可以加0.5微升，buffer 1.5微升，水应该是5.5微升，这个体系得注意下，尤其buffer加的不对会很影响酶切。 看你目前的结果，首先PCR产物的量不太均匀，建议PCR产物可以少加一点例如5微升，体系中用水补齐到15微升，可以保证在最佳酶切时间内都能切完。2.5小时看来是偏长了（带型有点儿不齐，怕是降解），中间几个样品1.5小时的感觉比例不是很对，因此要加长，2H比较合适（700+和500+的亮度比较正常），建议用2h。 发自小木虫Android客户端 |
10楼2016-05-12 09:08:34