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数到三咱就撤

新虫 (初入文坛)

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[求助] PCR产物做酶切已有2人参与

PCR产物片段大小是745bp，要做的是通过酶切分基因型，不同的酶切结果对应不同的基因型。酶切后共有三种基因型，第一种是酶切后两条带，528和217；第二种是三条带，745，528和217；第三种是一条带，745。现在酶切结果最多的时候能出现五条带，分别在1000左右、745、528、500左右、217。用的酶是thermo的Apa I.PCR体系是15微升，之后直接加0.5微升的酶和1微升的buffer,酶切3小时。哪位大神能赐教一下这是怎么个情况？之前做的都没有出现这种情况，酶切之后条带怎么会变大呢？？

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1楼 2016-05-09 16:28:15

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jackyoung

新虫 (正式写手)

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以后遇到这种酶切问题直接将PCR产物稀释两倍进行酶切，即内切酶+buffer+水配2X mix，一般可以保证排除PCR产物影响酶切的可能。酶切时间稍微控制一下，比如1hr（好像ApaI易失活，多了也没用，半衰期30min ??），至于结果，在有干扰的条件下你只需要关注特异条带即可，比如亲本带型中特异的条带分别为217/500+, 745单条带，和杂合带型。

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