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www790501

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于载体和pcr产物双酶切后的酶连问题

将载体质粒的多克隆位点(相距70bp左右)双酶切后,与同样进行过的双酶切产物进行酶连,它们之间量的比例如何?酶连效率怎样?我做了几次酶连后,转化大肠杆菌效果都不理想,一个转化子都没有长,不知道什么问题。请赐教!
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fwcyue

木虫 (正式写手)

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www790501: 金币+1, 有帮助 2012-11-15 19:19:07
我们实验室倾向于 (质粒用量*目标基因的大小)/ 质粒的大小*3=目的基因用量,转化效率比较高。
2楼2012-11-15 00:35:02
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


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www790501: 金币+1, 有帮助 2012-11-15 19:19:20
你用的连接酶上有最佳比例,然后根据摩尔比算出体积比就OK了
3楼2012-11-15 08:51:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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目的片段:载体的分子数为3或4就可以了。一般载体用50ng,再根据载体和目的片段大小计算出目的片段的用量。
4楼2012-11-15 09:02:24
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乐乐3952

铁杆木虫 (正式写手)

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www790501: 金币+1, 有帮助 2012-11-15 19:19:42
一般酶连的话,条带比较清晰可以考虑用1:3或1:4 ,700bp很好连,祝你好运
一花一世界、一叶一菩提
5楼2012-11-15 15:19:41
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hourl11

禁虫 (初入文坛)


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www790501: 金币+1, 有帮助 2012-11-15 19:19:52
本帖内容被屏蔽

6楼2012-11-15 15:45:45
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