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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 关于载体和pcr产物双酶切后的酶连问题
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www790501

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于载体和pcr产物双酶切后的酶连问题

将载体质粒的多克隆位点（相距70bp左右）双酶切后，与同样进行过的双酶切产物进行酶连，它们之间量的比例如何？酶连效率怎样？我做了几次酶连后，转化大肠杆菌效果都不理想，一个转化子都没有长，不知道什么问题。请赐教！
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1楼 2012-11-15 00:15:03
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
www790501: 金币+1, ★有帮助 2012-11-15 19:19:20
你用的连接酶上有最佳比例，然后根据摩尔比算出体积比就OK了
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3楼2012-11-15 08:51:12
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fwcyue

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
www790501: 金币+1, ★有帮助 2012-11-15 19:19:07
我们实验室倾向于 (质粒用量*目标基因的大小)/ 质粒的大小*3=目的基因用量，转化效率比较高。
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2楼2012-11-15 00:35:02
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
www790501: 金币+1, ★有帮助 2012-11-15 19:19:35
目的片段：载体的分子数为3或4就可以了。一般载体用50ng，再根据载体和目的片段大小计算出目的片段的用量。
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4楼2012-11-15 09:02:24
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乐乐3952

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
www790501: 金币+1, ★有帮助 2012-11-15 19:19:42
一般酶连的话，条带比较清晰可以考虑用1：3或1：4 ，700bp很好连，祝你好运
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一花一世界、一叶一菩提
5楼2012-11-15 15:19:41
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