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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于TA克隆的连接，T载体及大肠杆菌JM109的限制修饰系统
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DandelionLS

铜虫 (初入文坛)

[求助] 关于TA克隆的连接，T载体及大肠杆菌JM109的限制修饰系统 已有1人参与

1.平时我们设计的引物5’端是非磷酸化的，所以PCR产物在与T载体连接时相应PCR产物5‘端是没有连接的，这个地方的缺口要怎么修复？是依靠宿主的修复系统？
2.咱们从公司购买的T载体是线性的，未去磷酸化，这样的话是不是本身就有自连的可能呢？
3.基因工程中作为制作感受态的大肠杆菌细胞是否是限制-修饰系统缺陷菌？缺陷程度是什么样呢？
4.和第3题差不多同类问题，用大肠杆菌JM109克隆质粒，从中提取的质粒是否部分序列被甲基化？
5.利用质粒作为模板PCR反应产生新的序列，磷酸化自连接后用Dpn1酶切处理，说是除去原来的质粒序列，是这样的吗？
注：可能3,4,5为同一类问题。
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1楼 2015-08-04 16:49:00
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
DandelionLS: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2015-08-05 09:59:45
1磷酸化酶处理的质粒连接后，是在宿主体内修复的。2商品化的T载体自连很多，所以一般都做蓝白筛选。34常用的大肠杆菌菌株是限制修饰系统缺失的，大多存在dam,dcm两个甲基化酶，故还有甲基化。5DpnI识别dam甲基化模式，切割甲基化的序列，故会切割质粒模版，而不切割PCR产物。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2015-08-04 19:00:54
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DandelionLS

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2015-08-04 19:00:54
1磷酸化酶处理的质粒连接后，是在宿主体内修复的。2商品化的T载体自连很多，所以一般都做蓝白筛选。34常用的大肠杆菌菌株是限制修饰系统缺失的，大多存在dam,dcm两个甲基化酶，故还有甲基化。5DpnI识别dam甲基化模式 ...

谢谢了！
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3楼2015-08-05 09:57:51
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