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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于LA产物连接的问题
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aegeand

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于LA产物连接的问题

大家好，近一段时间超级郁闷，不知道实验室撞了什么邪，LAPCR产物就是连接不上去。

我的目的片段在3.4 左右，LA扩增后，割胶回收目的片段，电泳检测回收结果，用最普通的taq加A尾（听说LA的加尾效率不是很高），用PCR产物纯化试剂盒纯化，在电泳检测产物，测浓度。

由于片段比较长，所以在连接之前将产物放到65度15分钟，希望他能够完全伸展，然后连接。问题就出在下面：我分别用fermentas T4连接酶，pEASY-T和pMD19连接系统，载体与插入片段的比例1：3，1：1都试过，平板上也能长出白斑，可是每题提完质粒，一鉴定，都是空载体，郁闷的要死，连接2个月都没有成功，已经到了崩溃的边缘。

顺便说一声，实验室都是这样的结果，请大家帮我分析分析原因到底出在什么地方？本人不胜感激。

谢谢。
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1楼 2011-05-07 19:57:24
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aegeand

铜虫 (小有名气)
我一般都是过夜连接。原来都没有问题。而且3kb的片段也能连接上。不过那时候是在美国，用的就是pEASY T载体，怎么回国后就不好用了呢？
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2楼2011-05-07 19:59:36
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baby0032

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
1楼: Originally posted by aegeand at 2011-05-07 19:57:24:
大家好，近一段时间超级郁闷，不知道实验室撞了什么邪，LAPCR产物就是连接不上去。

我的目的片段在3.4 左右，LA扩增后，割胶回收目的片段，电泳检测回收结果，用最普通的taq加A尾（听说LA的加尾效率不是很高） ...

会不会是实验室什么污染呢？还有请问楼主用TAQ酶加尾怎么加呢？
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3楼2011-12-16 11:33:06
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