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关于LA产物连接的问题
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大家好，近一段时间超级郁闷，不知道实验室撞了什么邪，LAPCR产物就是连接不上去。 我的目的片段在3.4 左右，LA扩增后，割胶回收目的片段，电泳检测回收结果，用最普通的taq加A尾（听说LA的加尾效率不是很高），用PCR产物纯化试剂盒纯化，在电泳检测产物，测浓度。 由于片段比较长，所以在连接之前将产物放到65度15分钟，希望他能够完全伸展，然后连接。问题就出在下面：我分别用fermentas T4连接酶，pEASY-T和pMD19连接系统，载体与插入片段的比例1：3，1：1都试过，平板上也能长出白斑，可是每题提完质粒，一鉴定，都是空载体，郁闷的要死，连接2个月都没有成功，已经到了崩溃的边缘。 顺便说一声，实验室都是这样的结果，请大家帮我分析分析原因到底出在什么地方？本人不胜感激。 谢谢。 |
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