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aegeand

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于LA产物连接的问题

大家好,近一段时间超级郁闷,不知道实验室撞了什么邪,LAPCR产物就是连接不上去。

我的目的片段在3.4 左右,LA扩增后,割胶回收目的片段,电泳检测回收结果,用最普通的taq加A尾(听说LA的加尾效率不是很高),用PCR产物纯化试剂盒纯化,在电泳检测产物,测浓度。

由于片段比较长,所以在连接之前将产物放到65度15分钟,希望他能够完全伸展,然后连接。问题就出在下面:我分别用fermentas T4连接酶,pEASY-T和pMD19连接系统,载体与插入片段的比例1:3,1:1都试过,平板上也能长出白斑,可是每题提完质粒,一鉴定,都是空载体,郁闷的要死,连接2个月都没有成功,已经到了崩溃的边缘。

顺便说一声,实验室都是这样的结果,请大家帮我分析分析原因到底出在什么地方?本人不胜感激。

谢谢。
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baby0032

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
1楼: Originally posted by aegeand at 2011-05-07 19:57:24:
大家好,近一段时间超级郁闷,不知道实验室撞了什么邪,LAPCR产物就是连接不上去。

我的目的片段在3.4 左右,LA扩增后,割胶回收目的片段,电泳检测回收结果,用最普通的taq加A尾(听说LA的加尾效率不是很高) ...

会不会是实验室什么污染呢?还有请问楼主用TAQ酶加尾怎么加呢?
3楼2011-12-16 11:33:06
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aegeand

铜虫 (小有名气)

我一般都是过夜连接。原来都没有问题。而且3kb的片段也能连接上。不过那时候是在美国,用的就是pEASY T载体,怎么回国后就不好用了呢?
2楼2011-05-07 19:59:36
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