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[求助]
急！PCR产物做模板，改变primer做第二次PCR，无条带！ 已有1人参与
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求助： 想通过三次PCR，延长序列，目标size：5kb 第一次PCR，5kb处为主带，下方small size有杂带，为避免下次PCR干扰，切胶回收产物，纯化后跑胶，再无杂带，条带清洗明亮。 用该产物做第二次PCR，希望在5‘端加入50bp，故此次PCR的5’primer为70bp，其中有28bp与第一次PCR primer重合，3‘ primer与第一次完全相同25bp，做第二次PCR，怎么做，都没有结果，只有非常小的区域有杂带。尝试更换新的酶（Phusion）和buffer，尝试不同的program都无效，98°热启动，98°：30’’，61°：30’’，72°：2’30’’，优化过不同的退火温度，也用过4’的延长时间，都是一点产物都没有。查了很多资料，看了很多帖子，不知道问题究竟出在哪里。 请教各位，问题出在哪里，有做过类似的实验请给点建议。 谢谢！ |
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