| 查看: 1017 | 回复: 2 | ||
[求助]
急！PCR产物做模板，改变primer做第二次PCR，无条带！ 已有1人参与
|
|
求助： 想通过三次PCR，延长序列，目标size：5kb 第一次PCR，5kb处为主带，下方small size有杂带，为避免下次PCR干扰，切胶回收产物，纯化后跑胶，再无杂带，条带清洗明亮。 用该产物做第二次PCR，希望在5‘端加入50bp，故此次PCR的5’primer为70bp，其中有28bp与第一次PCR primer重合，3‘ primer与第一次完全相同25bp，做第二次PCR，怎么做，都没有结果，只有非常小的区域有杂带。尝试更换新的酶（Phusion）和buffer，尝试不同的program都无效，98°热启动，98°：30’’，61°：30’’，72°：2’30’’，优化过不同的退火温度，也用过4’的延长时间，都是一点产物都没有。查了很多资料，看了很多帖子，不知道问题究竟出在哪里。 请教各位，问题出在哪里，有做过类似的实验请给点建议。 谢谢！ |
回复此楼» 猜你喜欢
恩诺沙星（Enrofloxacin）科研解析：分子特征、LC-MS/MS 检测与实验室使用要点
已经有0人回复
-
Calderasib理化性质与实验操作技术笔记
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有282人回复
-
RMC-6291怎么用？RAS(ON) 三重复合物工具化合物的实验室实操要点
已经有0人回复
-
苯并呋咱全解析：NBD 荧光衍生化试剂母核的化学特性与实验室应用
已经有0人回复
-
生物质炭与活化剂氢氧化钾混合注意事项
已经有0人回复
-
科研人必读：新一代 KRAS G12C 抑制剂 Olomorasib 的研究进展
已经有0人回复
-
BT-11（Omilancor）研究化合物全解析：从分子结构到实验应用要点
已经有0人回复
-
富马酸贝达喹啉：二芳基喹啉类工具化合物的化学特征
已经有0人回复
-
BT投稿with editor状态快两周了，正常吗
已经有25人回复
-
Silevertinib（BDTX-1535）结构拆解：炔基双环片段为何成为合成瓶颈
已经有0人回复
kangaroo0513
新虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 154 (高中生)
- 金币: 2277.4
- 散金: 100
- 红花: 29
- 帖子: 464
- 在线: 119.4小时
- 虫号: 2621902
- 注册: 2013-08-28
- 专业: 细胞物质运输
2楼2015-09-03 15:59:31
3楼2015-10-20 16:06:18