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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 急！PCR产物做模板，改变primer做第二次PCR，无条带！
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嘻嘻小巫

金虫 (小有名气)

[求助] 急！PCR产物做模板，改变primer做第二次PCR，无条带！ 已有1人参与

求助：
想通过三次PCR，延长序列，目标size：5kb
第一次PCR，5kb处为主带，下方small size有杂带，为避免下次PCR干扰，切胶回收产物，纯化后跑胶，再无杂带，条带清洗明亮。
用该产物做第二次PCR，希望在5‘端加入50bp，故此次PCR的5’primer为70bp，其中有28bp与第一次PCR primer重合，3‘ primer与第一次完全相同25bp，做第二次PCR，怎么做，都没有结果，只有非常小的区域有杂带。尝试更换新的酶（Phusion）和buffer，尝试不同的program都无效，98°热启动，98°：30’’，61°：30’’，72°：2’30’’，优化过不同的退火温度，也用过4’的延长时间，都是一点产物都没有。查了很多资料，看了很多帖子，不知道问题究竟出在哪里。
请教各位，问题出在哪里，有做过类似的实验请给点建议。
谢谢！
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1楼 2015-09-03 05:05:12
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-20 16:55:55
最近我也遇到了相同的问题。更换引物吧，有的引物就是特别难P，我也不知道为毛。。。我做点突变，用重叠PCR，4个点突变，只有一个的重叠前半段P不出，其他的都好好的。。。

最近的经验值=
1.降低退火温度，试试gradient看看能不能跑出来目的条带
2.重新设计引物，不匹配区的碱基换换。。我能跑出来的引物和不能跑出来的引物就差两个碱基，相同位置一个是G一个是A。。。
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2楼2015-09-03 15:59:31
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弱者退散

铁虫 (小有名气)
会不会是上下游引物TM值相差太远的原因，毕竟上游引物那么长。
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3楼2015-10-20 16:06:18
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