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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 原核表达目的基因是直接PCR好 还是从构建的18t菌里提质粒好呢
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cherry--

金虫 (小有名气)

[求助] 原核表达目的基因是直接PCR好 还是从构建的18t菌里提质粒好呢 已有4人参与

原核表达第一步是直接PCR目的片段然后酶切，去与载体酶切片段连接，还是从构建的目的片段连18t的克隆菌里提质粒再酶切好呢？这两种方法大家觉得那种比较常用呀？
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1楼 2015-07-10 09:01:31
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cherry--: 金币+2, ★有帮助 2015-07-10 15:45:42
都行，但如果你需要对表达蛋白的基因密码子等进行优化，那还是用PCR吧。哦，对了，还有我们做完PCR构建的基因也不会直接导入表达载体中，一般也会先放到克隆载体中进行稳定，防止基因水解掉。
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
2楼2015-07-10 09:10:01
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仁者努力

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cherry--: 金币+1, ★有帮助 2015-07-10 15:45:53
两个都行，但最好还是先连接到t载体上。
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加油
3楼2015-07-10 13:54:03
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cherry--: 金币+2, ★有帮助 2015-07-10 15:46:04
做得熟练了就直接PCR目的片段然后酶切，与酶切的表达载体连接，转化表达宿主，省时。
如果才开始做克隆表达，保险起见，PCR后先连T载体，转化克隆宿主，测序验证后，提取质粒，酶切，连接，转化。
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4楼2015-07-10 14:43:06
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hg30717580

木虫 (职业作家)

总经理

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-07-10 21:10:58
一般先连到T载体上，然后在去酶切回收目的片段，再与酶切的载体片段连接转化。连到T载体后再酶切的效果比PCR直接酶切好
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突破自我，喜迎曙光
5楼2015-07-10 15:29:57
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