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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » 毕赤酵母菌落PCR筛选，这样到底是转化进去没？
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

[求助] 毕赤酵母菌落PCR筛选，这样到底是转化进去没？已有3人参与

我做的GS115，用Takara的Direct PCR裂解液裂解菌落，然后做菌落PCR，一端通用引物，一端特异性引物P不出来条带。
  然后我用两端特异性引物P，结果有的菌就P出目的条带了。
  最诡异的是我同时选了一个样做两端通用引物，P出了两条带，一条3K左右，一条淡淡的500bp，GS115本身有个条带就在3Kb附近，空载载体能P出500bp的条带，这样的话这个样就是空载咯？可是特异性引物P的时候，这个样是有目的条带的。
  
  在我看来，用两端通用引物；一端通用一端特异；两端都特异；三种方法只要P出目的条带，结果不都是一样的吗。不然目的条带哪里来的，就算引物不够特异，也不会刚好是目的条带的大小啊。我目的条带3kb，没那么容易假阳性吧。看文献很多人都写用通用引物鉴定，那如果是我这种情况，到底是转化了没？P不出条带又是什么原因呢？
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1楼2015-07-08 16:37:49
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jjwhl at 2015-07-23 15:21:30
有可能是转化时候未导入酵母中的目的片段，用两端引物就给P出来了

可是这样的话也应该是什么引物都能P出来吧？因为我的线性化位点是PmeI或者SalI，都不破坏5AOX位点和3AOX位点。线性化不会把我质粒上的片段单独切出来，肯定是质粒和片段一起的一条……
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9楼2015-07-26 22:28:39
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
自己顶一下，感觉这个应该比较基础啊，没有高手来解答么！

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2楼2015-07-10 15:18:49
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awaken2013

铜虫 (小有名气)
试过takara的那个裂解液。。一点都不好用，重复性极差。
建议直接玻璃珠法提基因组是最准确的。不要再抱有侥幸心理，直接PCR只会更浪费时间。
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3楼2015-07-13 23:50:09
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by awaken2013 at 2015-07-13 23:50:09
试过takara的那个裂解液。。一点都不好用，重复性极差。
建议直接玻璃珠法提基因组是最准确的。不要再抱有侥幸心理，直接PCR只会更浪费时间。

谢谢你的回复～极差是怎么个情况？假阳假阴还是一会有条带一会又没条带？我信任这个裂解液是因为之前做的随便怎么P都能P出来……那用试剂盒提基因组可以吗？

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4楼2015-07-15 08:17:24
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