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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TA克隆相关问题
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qaz139687

新虫 (小有名气)

[求助] TA克隆相关问题 已有8人参与

PCR产物用PMD 19T载体  16℃过夜连接后，与DH5感受态细胞转化，涂平板，挑菌，液体培养基培养后，菌液变浑浊，然后做了菌落PCR有目的条带，送公司测序，公司说菌落浓度太低，这是为什么？是我感受态的问题吗
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1楼 2015-07-04 23:14:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ppppppppp

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
送测序的菌需要继续培养的，只是浑浊肯定不行，因为他们也要先抽质粒再测序的。菌落pcr和测序对菌浓度要求应该不一样的。
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初来乍到，请多指教
4楼2015-07-05 14:56:56
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dehong1573

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qaz139687: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-07-06 16:02:13
换家公司吧，如果可以的话，菌溶度不够他们不会摇啊
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科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
8楼2015-07-06 07:49:14
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普通回帖

qaz139687

新虫 (小有名气)
来个人指点指点啊
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2楼2015-07-05 13:25:08
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a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
感谢参与，应助指数 +1
公司可以帮你转化了之后再抽提质粒测序的，估计是他们不愿意
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3楼2015-07-05 14:42:12
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ppppppppp at 2015-07-05 14:56:56
送测序的菌需要继续培养的，只是浑浊肯定不行，因为他们也要先抽质粒再测序的。菌落pcr和测序对菌浓度要求应该不一样的。

我培养了5h后，做完菌落PCR就送去测序了，不是说摇菌太久的话会细菌死亡或者是amp会失效？请问下摇菌的话摇多少小时后送测比较好，之前一次摇了24个小时，公司说我的细菌都不长，说我摇太久了。另外菌液送公司的话，公司不是也会培养的嘛
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5楼2015-07-05 19:24:19
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by a13515517892 at 2015-07-05 14:42:12
公司可以帮你转化了之后再抽提质粒测序的，估计是他们不愿意

你的意思是可以送PCR产物，让他们帮忙连接转化摇菌在提质粒吗
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6楼2015-07-05 19:52:56
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lxzk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
qaz139687: 金币+1, ★有帮助 2015-07-06 16:01:51
引用回帖:
5楼: Originally posted by qaz139687 at 2015-07-05 19:24:19
我培养了5h后，做完菌落PCR就送去测序了，不是说摇菌太久的话会细菌死亡或者是amp会失效？请问下摇菌的话摇多少小时后送测比较好，之前一次摇了24个小时，公司说我的细菌都不长，说我摇太久了。另外菌液送公司的话 ...

12-18小时之间吧，24太长，5小时又太短了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2015-07-05 20:56:35
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小爷不狂91

禁虫 (著名写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
9楼2015-07-06 08:12:15
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 小爷不狂91 at 2015-07-06 08:12:15
你怎么想的呢，到了这一步，你还用未纯化的pcr产物干嘛？如果你的菌液长起来了，直接取600～1000ul送公司测序，他们会提取质粒的，实在不放心，自己提取质粒做了验证有目的基因送质粒去测序，毕竟公司工作的都是本科 ...

可能是我描述有问题，我是做完菌液PCR后，有条带，送的是菌液，不是PCR产物。。
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10楼2015-07-06 15:59:48
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