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wushenchao

新虫 (初入文坛)

[求助] 如何调整实验条件优化qPCR的效率 已有2人参与

大虾们,我试图通过稀释质粒标本构建应用于qPCR的标准曲线。采用的是Taqman MGB探针,目的拷贝数范围在10^1-10^6不等,因此需要配置相应的标准品。在建方法的时候,遇到了如下的问题,首先是qPCR的效率不如意(一般在-3.33附近,可以满足90%-110%之间,但是我只有70%左右)。还有就是低浓度的cp值跑不开,区分度不是很好。不知道有什么建议可以帮助到我,十分感谢!下图是前几次实验的结果仅供参考。25ul的体系中,1ul的引物以及1ul的taqman(均为10ng/ul的工作浓度),12.5的life mixII,之后根据需求配制模板和水的比例。退火延伸温度62摄氏度1min,循环数45。[img][/img]

如何调整实验条件优化qPCR的效率
DSC_0002.JPG
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xmcliulei

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
同学,你引物效率是用探针测得?质粒做标准品的话,引物特异性再不好一般溶解曲线也不会差到哪里去,毕竟你目的片段已经被高度富集了。建议你用SYBR green法做一个模板浓度梯度的标准曲线测定下引物扩增效率。个人感觉这个扩增效率是比较靠谱的~
2楼2015-06-01 23:33:48
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xuebaobingyu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
退火温度做个梯度

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2015-06-01 23:44:45
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wushenchao

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by xmcliulei at 2015-06-01 23:33:48
同学,你引物效率是用探针测得?质粒做标准品的话,引物特异性再不好一般溶解曲线也不会差到哪里去,毕竟你目的片段已经被高度富集了。建议你用SYBR green法做一个模板浓度梯度的标准曲线测定下引物扩增效率。个人感 ...

按照你说的就是要换一种染料进行实验了,但是因为特殊用途所以必须使用TaqmanMGB。我考虑的是一方面引物扩增的效率要好,还有就是探针的信号释放强度要与模板浓度的变化线性相关。而且该对引物和探针我都是选择他人文献,只是该作者并没有用此来跑10-10^5浓度的标准曲线。还是谢谢你的意见!
4楼2015-06-03 15:20:28
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wushenchao

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xuebaobingyu at 2015-06-01 23:44:45
退火温度做个梯度

那是不是可以认为,在标本经过严格的稀释混匀后,浓度和加入的模板量本身并不会对扩增曲线(多个曲线CP值之间的间隔和多个曲线CP值出现的时间)产生显著的影响?最需要关注的还是退火温度?
5楼2015-06-03 15:22:40
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xuebaobingyu

金虫 (正式写手)

扩增效率同样很重要,用primer epress设计引物成功率非常高

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
6楼2015-06-03 21:16:14
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1322324659

新虫 (小有名气)

兄台,你用Taqman MGB探针做点突变定量吗?
能告诉我你的通用预混液是哪里买的吗?
是Taqman MGB探针配套的还是只是Taqman的通用预混液?
非常感谢
7楼2015-06-23 11:21:42
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