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wushenchao

新虫 (初入文坛)

[求助] 如何调整实验条件优化qPCR的效率 已有2人参与

大虾们，我试图通过稀释质粒标本构建应用于qPCR的标准曲线。采用的是Taqman MGB探针，目的拷贝数范围在10^1-10^6不等，因此需要配置相应的标准品。在建方法的时候，遇到了如下的问题，首先是qPCR的效率不如意（一般在-3.33附近，可以满足90%-110%之间，但是我只有70%左右）。还有就是低浓度的cp值跑不开，区分度不是很好。不知道有什么建议可以帮助到我，十分感谢！下图是前几次实验的结果仅供参考。25ul的体系中，1ul的引物以及1ul的taqman（均为10ng/ul的工作浓度），12.5的life mixII，之后根据需求配制模板和水的比例。退火延伸温度62摄氏度1min，循环数45。[img][/img]

如何调整实验条件优化qPCR的效率
DSC_0002.JPG
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1楼 2015-06-01 22:35:04
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xmcliulei

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同学，你引物效率是用探针测得？质粒做标准品的话，引物特异性再不好一般溶解曲线也不会差到哪里去，毕竟你目的片段已经被高度富集了。建议你用SYBR green法做一个模板浓度梯度的标准曲线测定下引物扩增效率。个人感觉这个扩增效率是比较靠谱的~
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2楼2015-06-01 23:33:48
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xuebaobingyu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
退火温度做个梯度

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2015-06-01 23:44:45
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wushenchao

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xmcliulei at 2015-06-01 23:33:48
同学，你引物效率是用探针测得？质粒做标准品的话，引物特异性再不好一般溶解曲线也不会差到哪里去，毕竟你目的片段已经被高度富集了。建议你用SYBR green法做一个模板浓度梯度的标准曲线测定下引物扩增效率。个人感 ...

按照你说的就是要换一种染料进行实验了，但是因为特殊用途所以必须使用TaqmanMGB。我考虑的是一方面引物扩增的效率要好，还有就是探针的信号释放强度要与模板浓度的变化线性相关。而且该对引物和探针我都是选择他人文献，只是该作者并没有用此来跑10-10^5浓度的标准曲线。还是谢谢你的意见！
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4楼2015-06-03 15:20:28
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wushenchao

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xuebaobingyu at 2015-06-01 23:44:45
退火温度做个梯度

那是不是可以认为，在标本经过严格的稀释混匀后，浓度和加入的模板量本身并不会对扩增曲线（多个曲线CP值之间的间隔和多个曲线CP值出现的时间）产生显著的影响？最需要关注的还是退火温度？
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5楼2015-06-03 15:22:40
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xuebaobingyu

金虫 (正式写手)
扩增效率同样很重要，用primer epress设计引物成功率非常高

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2015-06-03 21:16:14
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1322324659

新虫 (小有名气)
兄台，你用Taqman MGB探针做点突变定量吗？
能告诉我你的通用预混液是哪里买的吗？
是Taqman MGB探针配套的还是只是Taqman的通用预混液？
非常感谢
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7楼2015-06-23 11:21:42
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