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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 实时荧光定量PCR之标准曲线的制作
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十分想念

新虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量PCR之标准曲线的制作 已有2人参与

新手做实时定量PCR，好多东西不懂，大家帮忙看下，我是从标准曲线做起的，前面几次都是做的10个浓度梯度，这一次做的样分别是无菌水空白，180pg/uL的质粒标准品，1.8ng/uL的质粒标准品，但是每个实验一样的情况：无论是水，还是标准品，不论浓度梯度，所有的CT都是25左右，根本没有任何区别，这是为什么啊？求指导

实时荧光定量PCR之标准曲线的制作
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实时荧光定量PCR之标准曲线的制作-1
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实时荧光定量PCR之标准曲线的制作-2
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实时荧光定量PCR之标准曲线的制作-3
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实时荧光定量PCR之标准曲线的制作-4
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实时荧光定量PCR之标准曲线的制作-5
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加油
1楼 2015-05-18 10:01:37
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love_st

金虫 (著名写手)
毋庸置疑，污染
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2楼2015-05-18 13:35:51
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十分想念

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2015-05-18 13:35:51
毋庸置疑，污染

只是污染而已吗？那为什么十个浓度梯度的标准品的CT也是一样的，丝毫按照3个CT的差？
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加油
3楼2015-05-18 20:20:57
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laplacegsau

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-06-08 13:19:34
是不是引物不对，没有扩增目的片段。无菌水的Ct值其实是引物二聚体
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4楼2015-05-23 12:49:09
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erland21411

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-06-08 13:19:45
你的质粒梯度稀释的时候使用水稀释的？我原来做cDNA梯度的时候用水稀释会有很大误差的。
另外用水做模板的阴性对照CT都在25那反应体系肯定是有污染的，看你的熔点曲线，感觉还是有两个峰，最好换引物。
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5楼2015-05-23 22:33:50
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十分想念

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by laplacegsau at 2015-05-23 12:49:09
是不是引物不对，没有扩增目的片段。无菌水的Ct值其实是引物二聚体

恩，验证过了，是引物的问题，已经换过引物了，谢谢
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加油
6楼2015-06-08 11:32:03
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十分想念

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by erland21411 at 2015-05-23 22:33:50
你的质粒梯度稀释的时候使用水稀释的？我原来做cDNA梯度的时候用水稀释会有很大误差的。
另外用水做模板的阴性对照CT都在25那反应体系肯定是有污染的，看你的熔点曲线，感觉还是有两个峰，最好换引物。

已经换过引物了，但是有时结果也还会是那样，时好时坏，想问下怎么能少点污染呢，具体操作方面？求指点
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加油
7楼2015-06-08 11:33:43
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大头妞妞

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 十分想念 at 2015-06-08 11:32:03
恩，验证过了，是引物的问题，已经换过引物了，谢谢...

你好，我想请问一下，如果我的质粒标准品和水阴性对照样品，跑出来的标准曲线看到有两个峰就说明是我的引物有问题，是这样吗？为什么啊，可是我的引物用来做PCR特异性检测，水作为阴性对照也没扩出条带啊，可以解释一下这是什么意思吗
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8楼2017-03-13 21:49:40
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大鱼和珊瑚

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 大头妞妞 at 2017-03-13 21:49:40
你好，我想请问一下，如果我的质粒标准品和水阴性对照样品，跑出来的标准曲线看到有两个峰就说明是我的引物有问题，是这样吗？为什么啊，可是我的引物用来做PCR特异性检测，水作为阴性对照也没扩出条带啊，可以解释 ...

新手上路，请问楼主标准曲线的绘制必须构建质粒作为标准品吗？
可以用提取的DNA直接割胶纯化获得吗？

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9楼2018-01-11 19:26:56
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