应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 实时荧光定量PCR之标准曲线的制作
91/1返回列表
查看: 7689  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

十分想念

新虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量PCR之标准曲线的制作 已有2人参与

新手做实时定量PCR，好多东西不懂，大家帮忙看下，我是从标准曲线做起的，前面几次都是做的10个浓度梯度，这一次做的样分别是无菌水空白，180pg/uL的质粒标准品，1.8ng/uL的质粒标准品，但是每个实验一样的情况：无论是水，还是标准品，不论浓度梯度，所有的CT都是25左右，根本没有任何区别，这是为什么啊？求指导

实时荧光定量PCR之标准曲线的制作
9BB4A9C494D9315310A9B880A9716F2A.png


实时荧光定量PCR之标准曲线的制作-1
23D4A85A3CE928E16737D4D998E7EE8D.png


实时荧光定量PCR之标准曲线的制作-2
74F9FC829EB4DDABD3C6546915C73AEF.png


实时荧光定量PCR之标准曲线的制作-3
C98FB2CE3181054EE52412ABCA82D5AD.png


实时荧光定量PCR之标准曲线的制作-4
C4820DED2621281ADD5FC56A7F5B8B47.png


实时荧光定量PCR之标准曲线的制作-5
F1826063B78E8DED7AAFD4F94601F335.png
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
加油
1楼 2015-05-18 10:01:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

love_st

金虫 (著名写手)
毋庸置疑，污染
回复此楼
2楼2015-05-18 13:35:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

十分想念

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2015-05-18 13:35:51
毋庸置疑，污染

只是污染而已吗？那为什么十个浓度梯度的标准品的CT也是一样的，丝毫按照3个CT的差？
赞一下 回复此楼
加油
3楼2015-05-18 20:20:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

laplacegsau

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-06-08 13:19:34
是不是引物不对，没有扩增目的片段。无菌水的Ct值其实是引物二聚体
赞一下 回复此楼
4楼2015-05-23 12:49:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

erland21411

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-06-08 13:19:45
你的质粒梯度稀释的时候使用水稀释的？我原来做cDNA梯度的时候用水稀释会有很大误差的。
另外用水做模板的阴性对照CT都在25那反应体系肯定是有污染的，看你的熔点曲线，感觉还是有两个峰，最好换引物。
赞一下 回复此楼
5楼2015-05-23 22:33:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

十分想念

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by laplacegsau at 2015-05-23 12:49:09
是不是引物不对，没有扩增目的片段。无菌水的Ct值其实是引物二聚体

恩，验证过了，是引物的问题，已经换过引物了，谢谢
赞一下 回复此楼
加油
6楼2015-06-08 11:32:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

十分想念

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by erland21411 at 2015-05-23 22:33:50
你的质粒梯度稀释的时候使用水稀释的？我原来做cDNA梯度的时候用水稀释会有很大误差的。
另外用水做模板的阴性对照CT都在25那反应体系肯定是有污染的，看你的熔点曲线，感觉还是有两个峰，最好换引物。

已经换过引物了，但是有时结果也还会是那样，时好时坏，想问下怎么能少点污染呢，具体操作方面？求指点
赞一下(1人) 回复此楼
加油
7楼2015-06-08 11:33:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

大头妞妞

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 十分想念 at 2015-06-08 11:32:03
恩，验证过了，是引物的问题，已经换过引物了，谢谢...

你好，我想请问一下，如果我的质粒标准品和水阴性对照样品，跑出来的标准曲线看到有两个峰就说明是我的引物有问题，是这样吗？为什么啊，可是我的引物用来做PCR特异性检测，水作为阴性对照也没扩出条带啊，可以解释一下这是什么意思吗
赞一下 回复此楼
8楼2017-03-13 21:49:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

大鱼和珊瑚

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 大头妞妞 at 2017-03-13 21:49:40
你好，我想请问一下，如果我的质粒标准品和水阴性对照样品，跑出来的标准曲线看到有两个峰就说明是我的引物有问题，是这样吗？为什么啊，可是我的引物用来做PCR特异性检测，水作为阴性对照也没扩出条带啊，可以解释 ...

新手上路，请问楼主标准曲线的绘制必须构建质粒作为标准品吗？
可以用提取的DNA直接割胶纯化获得吗？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
9楼2018-01-11 19:26:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 十分想念 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭