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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于构建pET28a载体转化后IPTG诱导跑SDS-PAGE胶问题。
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linxiaolin08

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[求助] 关于构建pET28a载体转化后IPTG诱导跑SDS-PAGE胶问题。 已有9人参与

试验进行到了IPTG诱导表达后跑SDS-PAGE胶的环节，但是试了很多次了一直失败，我想了很多原因但是都没成功，跪求各位大神给我点指导，再做不出来毕不了业了。
首先，我获得了我的目的基因，与pET28a连接后，成功构建载体。我进行了菌液PCR验证，质粒PCR验证，质粒双酶切验证，之后是送去测序。所有的结果足够表明我已经构建载体成功了。
之后就是转化BL21表达菌株中。转到BL21表达菌株时间大概是15年1月份左右，直到过年后回来开始摇菌，诱导，跑胶，问题就是这时候出现的。
以下是我做试验的整个流程，望大神给些建议。
　　　1、诱导与提取目的蛋白
　　　① 菌种活化。重组载体pET-28a-SAMDC和空质粒pET-28a的单菌落，分别接种于25mL LB液体培养基（KanR）的试管中，37℃，180r/min，过夜振荡培养。
　　　② 菌种扩培。取活化好的菌种按1%的量接种于100mL的LB液体培养基（KanR），摇匀，37℃，200r/min，振荡培养3h。
　　　③ 融合蛋白的诱导表达。向菌液中分别加入终浓度的IPTG（0.1、0.5、1.0 mmol/L）作诱导剂，37℃，180r/min，振荡培养4h（3、4、5、6h）。
④ 目的蛋白的提取。
A. 经诱导后取1mL菌液，4℃ 12000g，10min收集菌体;吸出菌液，用0.5mL预冷的50mmol/LTris-Cl（pH7.4）漩涡振荡使沉淀的菌体复悬，4℃ 12000g，离心10min；再次吸出上清液，小心地吸净管壁上的液滴，尽可能地使沉淀不带有残留的液体；加入100uL ddH2O，漩涡振荡使沉淀复悬，一旦菌体分散开来立即加入等体积的1%×SDS磷酸缓冲液，继续振荡20s；超声波处理。超声处理为7min，超3s，停10s，功率为75w。超声波处理后，样品4℃ 12000g，10min，将上清移至另一管中，沉淀用少量1%SDS溶解，分别加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液；快速离心，将菌悬液收集在离心管底部，沸水浴中放置5min；分别取15uL样品进行SDS-PAGE电泳检测。
图片即为SDS胶跑完后的状态。我的蛋白预测应该是在40kDa左右，可是在40kDa左右处根本没有我的目的蛋白。反而在30kDa处出现奇怪的条带...
做了几次都是这样的状态。同实验室的也有人在做这一步，她的蛋白预测大小为38kDa，但是跑出来的胶跟我的一模一样。
还有一个同学她是前两次做成功了可以明显看到目的蛋白表达，在60kDa左右，但是从大概4月份开始条带就没有了，我们一直找不到原因，难道这个也是可以传染的？
去问实验室的小老师，老师说可能是我们IPTG诱导的时间有问题，但是按照他说的方法重新试了也不行。难道是因为驯化时间太久所以BL21这个菌太淘气了所以把我们的载体吐出去了？但是这种可能性也不算大啊，我们也没有反复冻融，更何况我们重新验证了，BL21菌株中确实有我们的质粒。现在真的是想不出来到底问题出在哪里。唯一能想到的就是IPTG失效了，下次准备把所有的试剂都重新配一遍，再重新来一次。还有别的什么原因会出现这样的情况么？如果胶做的不对会使条带消失么？？求！！！！！！！！跪求！！！！！！！！谢谢大家了。

关于构建pET28a载体转化后IPTG诱导跑SDS-PAGE胶问题。
IMG_1062.JPG
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1楼 2015-05-14 09:24:35
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luwei13566

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西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2015-05-16 23:17:04
linxiaolin08: 金币+25, ★★★很有帮助 2015-05-18 07:46:53
LZ你赶紧做一个空载的全细胞、破碎后上清、沉淀的PAGE，验证一下细胞沉淀里那条带在空载里是否存在。从全细胞图上看我不觉得是包涵体，你全细胞是怎么跑的带？包涵体的可能性一定要排除。
如果上面验证不是包涵体的话，那问题就很多了。你需要做很多的筛查。
1.测一下你载体上连接基因前端的T7启动子附近的序列，排除一下载体的问题，
2.因为你们实验室是集体出问题，我感觉你们的菌株需要换一下，你们的菌株是BL21还是BL21(DE3），如果是BL21你们谁都别想诱导出蛋白~，建议明天赶紧去其他做分子的实验室去借一管确定能诱导出蛋白的编号为BL21（DE3）宿主菌来做。问题多半出现在这里，你们实验室的菌株可能在DE3区段出现变化。
3.我估计不是基因序列本身的问题，你也可以检测一下你基因的稀有密码子看一下有问题没有。
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大家相互帮助哈
16楼2015-05-14 21:36:24
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linxiaolin08

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3楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-05-14 10:36:41
尝试低温诱导试试，改变IPTG浓度，还是不行的话，说明你的这个整个序列载体本身就是不表达，得从头进行了

你好，都有哪些原因可以导致整个序列载体本身不表达呢？那如果不可以的话我需要更换菌株么？
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8楼2015-05-14 14:27:35
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linxiaolin08

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最关键的是，空载体和我们连接目的基因后的载体诱导后没区别，我现在已经开始怀疑人生了...
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2楼2015-05-14 09:28:14
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

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linxiaolin08: 金币+5 2015-05-14 14:26:10
尝试低温诱导试试，改变IPTG浓度，还是不行的话，说明你的这个整个序列载体本身就是不表达，得从头进行了
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
3楼2015-05-14 10:36:41
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
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2楼: Originally posted by linxiaolin08 at 2015-05-14 09:28:14
最关键的是，空载体和我们连接目的基因后的载体诱导后没区别，我现在已经开始怀疑人生了...

是什么样的没区别，图上注释一下呗，那个是个，看你这菌是有目的条带的呀。
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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2015-05-14 11:32:08
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781055707

木虫 (著名写手)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-16 23:15:46
你用的蛋白上样BUFFER是什么,是非变性PAGE蛋白上样缓冲液(5X)还是变性的，你可以做个免疫印迹看下。
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采菊东篱下，悠然见南山。
5楼2015-05-14 11:36:05
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zhang6871

银虫 (正式写手)
不表达更换表达菌株试一试
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过于功利，浮躁，布满灰尘的心都是创新的杀手!多记，心静，多动手，贴近大自然!
6楼2015-05-14 11:43:25
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-16 23:16:03
表达蛋白和预期大小不一样，首先看一下你设计的时候是否有移码问题，如果确定没有，建议用WB看看究竟是不是你要的蛋白。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2015-05-14 13:22:03
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linxiaolin08

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4楼: Originally posted by 781055707 at 2015-05-14 11:32:08
是什么样的没区别，图上注释一下呗，那个是个，看你这菌是有目的条带的呀。...

从下到上条带顺序依次是：Marker（94kDa，66.2，45,33,26）、转空载体、转SAMDC基因0.1mM IPTG诱导总蛋白，转SAMDC基因0.1mM IPTG诱导上清蛋白、转SAMDC基因0.1mM IPTG诱导沉淀蛋白、转SAMDC基因0.5mM IPTG诱导总蛋白、转SAMDC基因0.5mM IPTG诱导上清蛋白、转SAMDC基因0.5mM IPTG诱导沉淀蛋白、转SAMDC基因1mM IPTG诱导总蛋白、转SAMDC基因1mM IPTG诱导上清蛋白、转SAMDC基因1mM IPTG诱导沉淀蛋白。
33kDa左右处确实是有一条条带，但是大小与我预测的不相符。我的预测大小是40kDa左右，我同学预测大小是38kDa左右，我们俩同时跑胶跑出来的东西是一模一样的，无论是条带的大小，还是条带的颜色深浅，甚至是位置...
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9楼2015-05-14 14:37:43
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linxiaolin08

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5楼: Originally posted by 781055707 at 2015-05-14 11:36:05
你用的蛋白上样BUFFER是什么,是非变性PAGE蛋白上样缓冲液(5X)还是变性的，你可以做个免疫印迹看下。

变性缓冲液  5×
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10楼2015-05-14 14:38:59
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