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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于构建pET28a载体转化后IPTG诱导跑SDS-PAGE胶问题。
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linxiaolin08

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12楼: Originally posted by mataomatao at 2015-05-14 15:04:42
有些蛋白可能会本体表达，这种情况很少。另外你的蛋白为什么不做质谱；还有就是很多质粒表达的条件需要优化方能表达。

想先跑SDS后切胶，胶内酶解后上质谱。因为当初就是这么设计的实验技术路线啊。哭死。
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21楼2015-06-03 09:30:09
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
22楼2015-06-03 11:22:37
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linxiaolin08

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13楼: Originally posted by 781055707 at 2015-05-14 16:11:55
空载体的沉淀那，有跑过吗？你的蛋白在沉淀里，大小为36——38左右，由图可见，不是33。0.1mM———1mM IPTG都能表达。
加做个空载体0.5mM IPTG诱诱导跑下沉淀，你就知道了，到底有没有表达。...

你好  我做了空载体的0.5mM IPTG诱导 总蛋白  上清 沉淀这次都跑了 空载体跑出的图片跟基因连接后的没有区别  很揪心...  可以说明我的蛋白根本就没有表达么？到目前为止我仍然没有找到原因...需要重新开始了...
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23楼2015-06-22 17:04:47
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linxiaolin08

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16楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-05-14 21:36:24
LZ你赶紧做一个空载的全细胞、破碎后上清、沉淀的PAGE，验证一下细胞沉淀里那条带在空载里是否存在。从全细胞图上看我不觉得是包涵体，你全细胞是怎么跑的带？包涵体的可能性一定要排除。
如果上面验证不是包涵体的 ...

细胞沉淀里的那条带在空载体里仍然存在...
超声完以后直接取样品就是总蛋白。之后离心，取上清就是上清样品，取沉淀就是沉淀样品...我们重新制作了感受态重新转化诱导之后还是不行。但是你说如果DE3区段出现变化为什么我一个同学她前两次做成功了之后就不行了呢？太纠结了...
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24楼2015-06-22 17:09:17
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
24楼: Originally posted by linxiaolin08 at 2015-06-22 17:09:17
细胞沉淀里的那条带在空载体里仍然存在...
超声完以后直接取样品就是总蛋白。之后离心，取上清就是上清样品，取沉淀就是沉淀样品...我们重新制作了感受态重新转化诱导之后还是不行。但是你说如果DE3区段出现变化为 ...

既然空载和你的重组质粒的菌都有那条比较明显的带，那总蛋白和上清在你的目的蛋白附近是否有差异？如果没有差别那我可以理解为：你的蛋白根本没有表达，所以下一步的工作就是如何让蛋白表达。
可能的问题无外乎以下几个方面：
基因相关的问题：1.你用于诱导的菌所含载体上是否还有你的基因，从你现在用于诱导的BL21里面提个质粒看看大小对不对？你其他两个同学也出不来蛋白，要不你们一起做一下筛查？2.你的基因是否插入到正确的位置，28a酶切位点选择不合适会出现移码的，再看看你的酶切位点和前端标签的读码框是否一致？你的基因序列是否正确，把测序结果再看看，特别是载体和基因连接处有没有问题？

载体的问题：1.给公司测个序看看多克隆位点前端有没有问题，28a多克隆位点前面好几个标签呢，从rbs序列开始往后测序看看前端序列是不是有问题，前端标签有没有移码？rbs序列正常不正常？T7启动子序列正常不正常？2.28a前端那么多标签有没有把这些序列加起来算一下蛋白的大小？

宿主菌的问题本身就很复杂，也不好筛查，一般实验室大面积集体诱导不出蛋白才会考虑是否是菌株出现的问题，很多实验室的BL21（DE3)用的时间长了确实会出现一些所谓的菌株活力下降的问题。解决方法就是接最初保存的那种甘油管划线活化之后重新转化。也有实验室出现过宿主BL21(DE3)污染空载质粒的，还有染菌的，还有就是DE3区段出的问题，筛查起来非常麻烦。后两种情况一般都是不再用本实验室的菌株，向外面实验室接点确定没问题的BL21来用一用。

蛋白本身的问题：如果上述情况你们确定都没问题的话，找一本大肠稀有密码子表对照一下看看有没有大量、连续的稀有密码子出现？要不换换Rocetta（DE3)来试一试？你们的蛋白来源是哪里，主要功能是什么？是否会对代谢产生影响？你们实验室出问题那几个学生做的蛋白是否功能相近？

我认为可以换个菌株来看看，至于诱导条件，我建议30度，200rpm 1mM IPTG 直接过夜诱导个12小时看看情况，出来包涵体也不怕，关键看看能不能出蛋白。
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大家相互帮助哈
25楼2015-06-23 02:05:33
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罗伟August

银虫 (初入文坛)
楼主，你好！不知道您遇到的问题解决了没有，我现在也遇到你遇到的问题。如果您已经解决问题，希望能给我一些建议和帮助！谢谢！
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我生，不负
26楼2016-04-22 14:55:42
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