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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于构建pET28a载体转化后IPTG诱导跑SDS-PAGE胶问题。
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linxiaolin08

捐助贵宾 (初入文坛)

[求助] 关于构建pET28a载体转化后IPTG诱导跑SDS-PAGE胶问题。 已有9人参与

试验进行到了IPTG诱导表达后跑SDS-PAGE胶的环节，但是试了很多次了一直失败，我想了很多原因但是都没成功，跪求各位大神给我点指导，再做不出来毕不了业了。
首先，我获得了我的目的基因，与pET28a连接后，成功构建载体。我进行了菌液PCR验证，质粒PCR验证，质粒双酶切验证，之后是送去测序。所有的结果足够表明我已经构建载体成功了。
之后就是转化BL21表达菌株中。转到BL21表达菌株时间大概是15年1月份左右，直到过年后回来开始摇菌，诱导，跑胶，问题就是这时候出现的。
以下是我做试验的整个流程，望大神给些建议。
　　　1、诱导与提取目的蛋白
　　　① 菌种活化。重组载体pET-28a-SAMDC和空质粒pET-28a的单菌落，分别接种于25mL LB液体培养基（KanR）的试管中，37℃，180r/min，过夜振荡培养。
　　　② 菌种扩培。取活化好的菌种按1%的量接种于100mL的LB液体培养基（KanR），摇匀，37℃，200r/min，振荡培养3h。
　　　③ 融合蛋白的诱导表达。向菌液中分别加入终浓度的IPTG（0.1、0.5、1.0 mmol/L）作诱导剂，37℃，180r/min，振荡培养4h（3、4、5、6h）。
④ 目的蛋白的提取。
A. 经诱导后取1mL菌液，4℃ 12000g，10min收集菌体;吸出菌液，用0.5mL预冷的50mmol/LTris-Cl（pH7.4）漩涡振荡使沉淀的菌体复悬，4℃ 12000g，离心10min；再次吸出上清液，小心地吸净管壁上的液滴，尽可能地使沉淀不带有残留的液体；加入100uL ddH2O，漩涡振荡使沉淀复悬，一旦菌体分散开来立即加入等体积的1%×SDS磷酸缓冲液，继续振荡20s；超声波处理。超声处理为7min，超3s，停10s，功率为75w。超声波处理后，样品4℃ 12000g，10min，将上清移至另一管中，沉淀用少量1%SDS溶解，分别加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液；快速离心，将菌悬液收集在离心管底部，沸水浴中放置5min；分别取15uL样品进行SDS-PAGE电泳检测。
图片即为SDS胶跑完后的状态。我的蛋白预测应该是在40kDa左右，可是在40kDa左右处根本没有我的目的蛋白。反而在30kDa处出现奇怪的条带...
做了几次都是这样的状态。同实验室的也有人在做这一步，她的蛋白预测大小为38kDa，但是跑出来的胶跟我的一模一样。
还有一个同学她是前两次做成功了可以明显看到目的蛋白表达，在60kDa左右，但是从大概4月份开始条带就没有了，我们一直找不到原因，难道这个也是可以传染的？
去问实验室的小老师，老师说可能是我们IPTG诱导的时间有问题，但是按照他说的方法重新试了也不行。难道是因为驯化时间太久所以BL21这个菌太淘气了所以把我们的载体吐出去了？但是这种可能性也不算大啊，我们也没有反复冻融，更何况我们重新验证了，BL21菌株中确实有我们的质粒。现在真的是想不出来到底问题出在哪里。唯一能想到的就是IPTG失效了，下次准备把所有的试剂都重新配一遍，再重新来一次。还有别的什么原因会出现这样的情况么？如果胶做的不对会使条带消失么？？求！！！！！！！！跪求！！！！！！！！谢谢大家了。

关于构建pET28a载体转化后IPTG诱导跑SDS-PAGE胶问题。
IMG_1062.JPG
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1楼 2015-05-14 09:24:35
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2015-05-16 23:17:04
linxiaolin08: 金币+25, ★★★很有帮助 2015-05-18 07:46:53
LZ你赶紧做一个空载的全细胞、破碎后上清、沉淀的PAGE，验证一下细胞沉淀里那条带在空载里是否存在。从全细胞图上看我不觉得是包涵体，你全细胞是怎么跑的带？包涵体的可能性一定要排除。
如果上面验证不是包涵体的话，那问题就很多了。你需要做很多的筛查。
1.测一下你载体上连接基因前端的T7启动子附近的序列，排除一下载体的问题，
2.因为你们实验室是集体出问题，我感觉你们的菌株需要换一下，你们的菌株是BL21还是BL21(DE3），如果是BL21你们谁都别想诱导出蛋白~，建议明天赶紧去其他做分子的实验室去借一管确定能诱导出蛋白的编号为BL21（DE3）宿主菌来做。问题多半出现在这里，你们实验室的菌株可能在DE3区段出现变化。
3.我估计不是基因序列本身的问题，你也可以检测一下你基因的稀有密码子看一下有问题没有。
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16楼2015-05-14 21:36:24
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by linxiaolin08 at 2015-05-18 07:53:10
你好，我做的空载体的确是没有分总蛋白上清蛋白和沉淀，根据你的建议我要去试试...但是，不是空载体的菌诱导后都分了上清和沉淀来跑胶在沉淀里面的确是出现了类似于目的蛋白的奇怪条带。我弱弱的问一嘴， ...

在33KD靠上一点，大概35KD的带是完全有可能是你的蛋白的~只要做一个空载的全细胞和沉淀就一目了然了
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大家相互帮助哈
19楼2015-05-18 13:10:38
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
24楼: Originally posted by linxiaolin08 at 2015-06-22 17:09:17
细胞沉淀里的那条带在空载体里仍然存在...
超声完以后直接取样品就是总蛋白。之后离心，取上清就是上清样品，取沉淀就是沉淀样品...我们重新制作了感受态重新转化诱导之后还是不行。但是你说如果DE3区段出现变化为 ...

既然空载和你的重组质粒的菌都有那条比较明显的带，那总蛋白和上清在你的目的蛋白附近是否有差异？如果没有差别那我可以理解为：你的蛋白根本没有表达，所以下一步的工作就是如何让蛋白表达。
可能的问题无外乎以下几个方面：
基因相关的问题：1.你用于诱导的菌所含载体上是否还有你的基因，从你现在用于诱导的BL21里面提个质粒看看大小对不对？你其他两个同学也出不来蛋白，要不你们一起做一下筛查？2.你的基因是否插入到正确的位置，28a酶切位点选择不合适会出现移码的，再看看你的酶切位点和前端标签的读码框是否一致？你的基因序列是否正确，把测序结果再看看，特别是载体和基因连接处有没有问题？

载体的问题：1.给公司测个序看看多克隆位点前端有没有问题，28a多克隆位点前面好几个标签呢，从rbs序列开始往后测序看看前端序列是不是有问题，前端标签有没有移码？rbs序列正常不正常？T7启动子序列正常不正常？2.28a前端那么多标签有没有把这些序列加起来算一下蛋白的大小？

宿主菌的问题本身就很复杂，也不好筛查，一般实验室大面积集体诱导不出蛋白才会考虑是否是菌株出现的问题，很多实验室的BL21（DE3)用的时间长了确实会出现一些所谓的菌株活力下降的问题。解决方法就是接最初保存的那种甘油管划线活化之后重新转化。也有实验室出现过宿主BL21(DE3)污染空载质粒的，还有染菌的，还有就是DE3区段出的问题，筛查起来非常麻烦。后两种情况一般都是不再用本实验室的菌株，向外面实验室接点确定没问题的BL21来用一用。

蛋白本身的问题：如果上述情况你们确定都没问题的话，找一本大肠稀有密码子表对照一下看看有没有大量、连续的稀有密码子出现？要不换换Rocetta（DE3)来试一试？你们的蛋白来源是哪里，主要功能是什么？是否会对代谢产生影响？你们实验室出问题那几个学生做的蛋白是否功能相近？

我认为可以换个菌株来看看，至于诱导条件，我建议30度，200rpm 1mM IPTG 直接过夜诱导个12小时看看情况，出来包涵体也不怕，关键看看能不能出蛋白。
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25楼2015-06-23 02:05:33
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