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关于构建pET28a载体转化后IPTG诱导跑SDS-PAGE胶问题。已有9人参与
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试验进行到了IPTG诱导表达后跑SDS-PAGE胶的环节，但是试了很多次了一直失败，我想了很多原因但是都没成功，跪求各位大神给我点指导，再做不出来毕不了业了。 首先，我获得了我的目的基因，与pET28a连接后，成功构建载体。我进行了菌液PCR验证，质粒PCR验证，质粒双酶切验证，之后是送去测序。所有的结果足够表明我已经构建载体成功了。 之后就是转化BL21表达菌株中。转到BL21表达菌株时间大概是15年1月份左右，直到过年后回来开始摇菌，诱导，跑胶，问题就是这时候出现的。 以下是我做试验的整个流程，望大神给些建议。 1、诱导与提取目的蛋白 ① 菌种活化。重组载体pET-28a-SAMDC和空质粒pET-28a的单菌落，分别接种于25mL LB液体培养基（KanR）的试管中，37℃，180r/min，过夜振荡培养。 ② 菌种扩培。取活化好的菌种按1%的量接种于100mL的LB液体培养基（KanR），摇匀，37℃，200r/min，振荡培养3h。 ③ 融合蛋白的诱导表达。向菌液中分别加入终浓度的IPTG（0.1、0.5、1.0 mmol/L）作诱导剂，37℃，180r/min，振荡培养4h（3、4、5、6h）。 ④ 目的蛋白的提取。 A. 经诱导后取1mL菌液，4℃ 12000g，10min收集菌体;吸出菌液，用0.5mL预冷的50mmol/LTris-Cl（pH7.4）漩涡振荡使沉淀的菌体复悬，4℃ 12000g，离心10min；再次吸出上清液，小心地吸净管壁上的液滴，尽可能地使沉淀不带有残留的液体；加入100uL ddH2O，漩涡振荡使沉淀复悬，一旦菌体分散开来立即加入等体积的1%×SDS磷酸缓冲液，继续振荡20s；超声波处理。超声处理为7min，超3s，停10s，功率为75w。超声波处理后，样品4℃ 12000g，10min，将上清移至另一管中，沉淀用少量1%SDS溶解，分别加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液；快速离心，将菌悬液收集在离心管底部，沸水浴中放置5min；分别取15uL样品进行SDS-PAGE电泳检测。 图片即为SDS胶跑完后的状态。我的蛋白预测应该是在40kDa左右，可是在40kDa左右处根本没有我的目的蛋白。反而在30kDa处出现奇怪的条带... 做了几次都是这样的状态。同实验室的也有人在做这一步，她的蛋白预测大小为38kDa，但是跑出来的胶跟我的一模一样。 还有一个同学她是前两次做成功了可以明显看到目的蛋白表达，在60kDa左右，但是从大概4月份开始条带就没有了，我们一直找不到原因，难道这个也是可以传染的？ 去问实验室的小老师，老师说可能是我们IPTG诱导的时间有问题，但是按照他说的方法重新试了也不行。难道是因为驯化时间太久所以BL21这个菌太淘气了所以把我们的载体吐出去了？但是这种可能性也不算大啊，我们也没有反复冻融，更何况我们重新验证了，BL21菌株中确实有我们的质粒。现在真的是想不出来到底问题出在哪里。唯一能想到的就是IPTG失效了，下次准备把所有的试剂都重新配一遍，再重新来一次。还有别的什么原因会出现这样的情况么？如果胶做的不对会使条带消失么？？求！！！！！！！！跪求！！！！！！！！谢谢大家了。  IMG_1062.JPG |
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luwei13566
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LZ你赶紧做一个空载的全细胞、破碎后上清、沉淀的PAGE，验证一下细胞沉淀里那条带在空载里是否存在。从全细胞图上看我不觉得是包涵体，你全细胞是怎么跑的带？包涵体的可能性一定要排除。 如果上面验证不是包涵体的话，那问题就很多了。你需要做很多的筛查。 1.测一下你载体上连接基因前端的T7启动子附近的序列，排除一下载体的问题， 2.因为你们实验室是集体出问题，我感觉你们的菌株需要换一下，你们的菌株是BL21还是BL21(DE3），如果是BL21你们谁都别想诱导出蛋白~，建议明天赶紧去其他做分子的实验室去借一管确定能诱导出蛋白的编号为BL21（DE3）宿主菌来做。问题多半出现在这里，你们实验室的菌株可能在DE3区段出现变化。 3.我估计不是基因序列本身的问题，你也可以检测一下你基因的稀有密码子看一下有问题没有。 |
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linxiaolin08
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