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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于构建pET28a载体转化后IPTG诱导跑SDS-PAGE胶问题。
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by linxiaolin08 at 2015-05-14 14:27:35
你好，都有哪些原因可以导致整个序列载体本身不表达呢？那如果不可以的话我需要更换菌株么？...

这就说来话长了，，本身序列的问题，在怎么优化条件还是不会表达，如果序列没有问题，那就要不断尝试摸索各个条件，比如载体、宿主菌、表达条件 试剂浓度等等
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
11楼2015-05-14 14:41:30
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
12楼2015-05-14 15:04:42
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by linxiaolin08 at 2015-05-14 14:37:43
从下到上条带顺序依次是：Marker（94kDa，66.2，45,33,26）、转空载体、转SAMDC基因0.1mM IPTG诱导总蛋白，转SAMDC基因0.1mM IPTG诱导上清蛋白、转SAMDC基因0.1mM IPTG诱导沉淀蛋白、转SAMDC基因0.5mM IPTG诱导总蛋 ...

空载体的沉淀那，有跑过吗？你的蛋白在沉淀里，大小为36——38左右，由图可见，不是33。0.1mM———1mM IPTG都能表达。
加做个空载体0.5mM IPTG诱诱导跑下沉淀，你就知道了，到底有没有表达。
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采菊东篱下，悠然见南山。
13楼2015-05-14 16:11:55
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wrongfeng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-16 23:16:41
1、重新提质粒转化一下。排除宿主菌问题。
2、无诱导、诱导空载、诱导重组质粒的菌一起跑电泳。排除IPTG问题、排除重组质粒问题。
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14楼2015-05-14 16:57:48
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chenqing7728

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以用自诱导培养基尝试一下就是ZYM5052.网上有参考文献。
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15楼2015-05-14 17:08:11
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2015-05-16 23:17:04
linxiaolin08: 金币+25, ★★★很有帮助 2015-05-18 07:46:53
LZ你赶紧做一个空载的全细胞、破碎后上清、沉淀的PAGE，验证一下细胞沉淀里那条带在空载里是否存在。从全细胞图上看我不觉得是包涵体，你全细胞是怎么跑的带？包涵体的可能性一定要排除。
如果上面验证不是包涵体的话，那问题就很多了。你需要做很多的筛查。
1.测一下你载体上连接基因前端的T7启动子附近的序列，排除一下载体的问题，
2.因为你们实验室是集体出问题，我感觉你们的菌株需要换一下，你们的菌株是BL21还是BL21(DE3），如果是BL21你们谁都别想诱导出蛋白~，建议明天赶紧去其他做分子的实验室去借一管确定能诱导出蛋白的编号为BL21（DE3）宿主菌来做。问题多半出现在这里，你们实验室的菌株可能在DE3区段出现变化。
3.我估计不是基因序列本身的问题，你也可以检测一下你基因的稀有密码子看一下有问题没有。
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大家相互帮助哈
16楼2015-05-14 21:36:24
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mazhenggen

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1、蛋白的预测理论分子量与SDS-PAGE跑出来的分量量有偏差是有可能的，先对做个WEST-blot 鉴别一下是否是你的目的蛋白。2、有的蛋白在大肠杆菌里就是无法表达，像不能正确折叠导致降解、mRNA易降解等，用酵母来表达也是一个不错的选择。
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我喜欢所以我做
17楼2015-05-17 11:03:38
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linxiaolin08

捐助贵宾 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-05-14 21:36:24
LZ你赶紧做一个空载的全细胞、破碎后上清、沉淀的PAGE，验证一下细胞沉淀里那条带在空载里是否存在。从全细胞图上看我不觉得是包涵体，你全细胞是怎么跑的带？包涵体的可能性一定要排除。
如果上面验证不是包涵体的 ...

你好，我做的空载体的确是没有分总蛋白上清蛋白和沉淀，根据你的建议我要去试试...但是，不是空载体的菌诱导后都分了上清和沉淀来跑胶在沉淀里面的确是出现了类似于目的蛋白的奇怪条带。我弱弱的问一嘴，如果是包涵体的话我40kDa左右的条带会可能在这个位置嘛？
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18楼2015-05-18 07:53:10
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by linxiaolin08 at 2015-05-18 07:53:10
你好，我做的空载体的确是没有分总蛋白上清蛋白和沉淀，根据你的建议我要去试试...但是，不是空载体的菌诱导后都分了上清和沉淀来跑胶在沉淀里面的确是出现了类似于目的蛋白的奇怪条带。我弱弱的问一嘴， ...

在33KD靠上一点，大概35KD的带是完全有可能是你的蛋白的~只要做一个空载的全细胞和沉淀就一目了然了
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大家相互帮助哈
19楼2015-05-18 13:10:38
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

上来直接高温诱导？为什么不先小量诱导试一试条件呢？

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天道酬勤
20楼2015-05-18 13:44:24
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