| 查看: 7788 | 回复: 25 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
linxiaolin08捐助贵宾 (初入文坛)
|
[求助]
关于构建pET28a载体转化后IPTG诱导跑SDS-PAGE胶问题。 已有9人参与
|
|
试验进行到了IPTG诱导表达后跑SDS-PAGE胶的环节，但是试了很多次了一直失败，我想了很多原因但是都没成功，跪求各位大神给我点指导，再做不出来毕不了业了。 首先，我获得了我的目的基因，与pET28a连接后，成功构建载体。我进行了菌液PCR验证，质粒PCR验证，质粒双酶切验证，之后是送去测序。所有的结果足够表明我已经构建载体成功了。 之后就是转化BL21表达菌株中。转到BL21表达菌株时间大概是15年1月份左右，直到过年后回来开始摇菌，诱导，跑胶，问题就是这时候出现的。 以下是我做试验的整个流程，望大神给些建议。 1、诱导与提取目的蛋白 ① 菌种活化。重组载体pET-28a-SAMDC和空质粒pET-28a的单菌落，分别接种于25mL LB液体培养基（KanR）的试管中，37℃，180r/min，过夜振荡培养。 ② 菌种扩培。取活化好的菌种按1%的量接种于100mL的LB液体培养基（KanR），摇匀，37℃，200r/min，振荡培养3h。 ③ 融合蛋白的诱导表达。向菌液中分别加入终浓度的IPTG（0.1、0.5、1.0 mmol/L）作诱导剂，37℃，180r/min，振荡培养4h（3、4、5、6h）。 ④ 目的蛋白的提取。 A. 经诱导后取1mL菌液，4℃ 12000g，10min收集菌体;吸出菌液，用0.5mL预冷的50mmol/LTris-Cl（pH7.4）漩涡振荡使沉淀的菌体复悬，4℃ 12000g，离心10min；再次吸出上清液，小心地吸净管壁上的液滴，尽可能地使沉淀不带有残留的液体；加入100uL ddH2O，漩涡振荡使沉淀复悬，一旦菌体分散开来立即加入等体积的1%×SDS磷酸缓冲液，继续振荡20s；超声波处理。超声处理为7min，超3s，停10s，功率为75w。超声波处理后，样品4℃ 12000g，10min，将上清移至另一管中，沉淀用少量1%SDS溶解，分别加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液；快速离心，将菌悬液收集在离心管底部，沸水浴中放置5min；分别取15uL样品进行SDS-PAGE电泳检测。 图片即为SDS胶跑完后的状态。我的蛋白预测应该是在40kDa左右，可是在40kDa左右处根本没有我的目的蛋白。反而在30kDa处出现奇怪的条带... 做了几次都是这样的状态。同实验室的也有人在做这一步，她的蛋白预测大小为38kDa，但是跑出来的胶跟我的一模一样。 还有一个同学她是前两次做成功了可以明显看到目的蛋白表达，在60kDa左右，但是从大概4月份开始条带就没有了，我们一直找不到原因，难道这个也是可以传染的？ 去问实验室的小老师，老师说可能是我们IPTG诱导的时间有问题，但是按照他说的方法重新试了也不行。难道是因为驯化时间太久所以BL21这个菌太淘气了所以把我们的载体吐出去了？但是这种可能性也不算大啊，我们也没有反复冻融，更何况我们重新验证了，BL21菌株中确实有我们的质粒。现在真的是想不出来到底问题出在哪里。唯一能想到的就是IPTG失效了，下次准备把所有的试剂都重新配一遍，再重新来一次。还有别的什么原因会出现这样的情况么？如果胶做的不对会使条带消失么？？求！！！！！！！！跪求！！！！！！！！谢谢大家了。  IMG_1062.JPG |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有86人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- pet28和pet21表达的蛋白对于蛋白结晶的区别
已经有8人回复
- 重组质粒不表达
已经有9人回复
- PET28载体的T7启动子是T7还是T7lac启动子？表达时需不需要IPTG诱导？
已经有6人回复
- pET-28a与pGEX-4T-1表达蛋白的区别
已经有10人回复
- 原核表达蛋白量很低
已经有13人回复
- 做了原核表达，表达量很低，求助~~
已经有16人回复
- 诱导蛋白表达 SDS-PAGE没有目的条带
已经有11人回复
- 目的蛋白表达量低
已经有4人回复
- IPTG诱导表达蛋白
已经有14人回复
- 原核表达载体蛋白诱导
已经有18人回复
- 原核表达和SDS-PAGE
已经有9人回复
- 关于Pet28a载体构建的质粒，蛋白表达量低是怎么回事。请大家帮忙
已经有8人回复
- 求指点用IPTG诱连接在pET28a上的蛋白表达
已经有13人回复
- 请问pET30b这个载体在IPTG诱导后有没有可能表达除了目的蛋白以外的其他蛋白？
已经有16人回复
- 做过跨膜蛋白原核表达的战友过来看看哦
已经有18人回复
- 原核表达 PET-30载体 目的蛋白分子量偏小？
已经有18人回复
- T7载体的IPTG诱导
已经有10人回复
- 大家帮忙看看我的蛋白电泳有目的带吗
已经有10人回复
- 【求助/交流】做过膜蛋白表达的看过来
已经有12人回复
- 【求助/交流】蛋白诱导表达不出目标条带
已经有41人回复
linxiaolin08
捐助贵宾 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 7.5
- 红花: 1
- 帖子: 41
- 在线: 6.6小时
- 虫号: 3415126
- 注册: 2014-09-14
- 专业: 生物化学
8楼2015-05-14 14:27:35
linxiaolin08
捐助贵宾 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 7.5
- 红花: 1
- 帖子: 41
- 在线: 6.6小时
- 虫号: 3415126
- 注册: 2014-09-14
- 专业: 生物化学
2楼2015-05-14 09:28:14
18761615793
木虫 (正式写手)
小虫
- MolEPI: 1
- 应助: 172 (高中生)
- 金币: 646.4
- 散金: 170
- 红花: 16
- 帖子: 863
- 在线: 144.9小时
- 虫号: 3603131
- 注册: 2014-12-19
- 专业: 抗体工程学
3楼2015-05-14 10:36:41
781055707
木虫 (著名写手)
- 应助: 291 (大学生)
- 金币: 3118.2
- 散金: 46
- 红花: 19
- 帖子: 2030
- 在线: 579.3小时
- 虫号: 3046113
- 注册: 2014-03-13
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
4楼2015-05-14 11:32:08
