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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于TOP10感受态细胞筛选阳性克隆
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玉雪晴儿

银虫 (正式写手)

[交流] 关于TOP10感受态细胞筛选阳性克隆 已有7人参与

最近在做重组质粒阳性克隆筛选，但是感受态细胞转化后涂平板，平板上都长成菌苔，一大片都是大肠杆菌，已经证明平板以及所使用的Ampcillin都可以正常使用，请各位虫友帮忙分析一下原因所在。
我的感受态细胞制备流程是这样的:
（1）从无Amp的LB平板上挑取单克隆菌体，打入3ml无Amp的LB液体培养液中，37℃，220rpm，振摇过夜；
（2）取过夜培养菌液1ml，加入100ml无Amp的LB中，220rpm，37℃培养约1h45min，分光光度计测OD600，OD600为0.4~0.5（实际测的时候已经达到0.650）；
（3）（此步开始在冰上操作）用圆底50ml Tube收集菌液，5000rpm，4℃，离心5min，弃上清，每40~50ml培液加5ml Sol. A，轻轻混匀，5000rpm，继续离心5min；
（4）弃上清，加5ml Sol B，轻轻混匀置于冰上30min;
（5）5000rpm，离心5min后弃上清，用15%甘油+85%SOL B混合液悬浮；
（6）每管200μl分装，保存于-80℃

热转化感受态细胞：
（1）从-80℃取出刚制备的TOP10感受态细胞200μl，置于冰上慢慢融化（约5min）；
（3）取10μl连接产物加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min；
（4）42℃金属浴热激90s，放于冰上冰冻2~3min(此过程中可以将冰浴移至超净台中，进行下一步准备)；
（5）加800μl无Amp的LB培养液，37℃，150rpm，摇床培养45min；
（6）取200μl菌液，加入新的1.5mlEP管中，再加入200μl无Amp的LB培养基稀释，轻轻吹打均匀后，全部加到Amp-LB平板上，涂布均匀。37℃恒温培养箱培养12h。
平板在培养箱中37℃过夜培养后，平板上长满了菌落，形成菌苔，按理说转化效率不应该这么高的，我的连接产物目的质粒的浓度不到5ng/μl，所使用的Amp-LB平板没有问题（同实验室的师姐用的同一批倒的平板来做转化，能成功），感受态细胞是当天上午做好，晚上就用于转化的，现在不知道问题出在哪里，请虫友们帮忙分析分析，多谢了！
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1楼 2015-04-09 11:53:24
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jiqinger

铁杆木虫 (正式写手)
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接种量太高，接120ul就可以了。
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123456
2楼2015-04-09 12:54:35
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浅语8905

新虫 (小有名气)
★
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涂平板时，少涂些，应该有单菌落。也可能是染菌了
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3楼2015-04-09 14:32:30
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starseacow

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-04-09 22:43:51
42度30秒就够了，最后一步建议取菌液离心，弃去上清，把细胞重悬于无菌水内再涂板。如果平板比较湿，在超净台吹一会再用

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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
4楼2015-04-09 14:39:33
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-04-09 22:46:08
把感受态涂个LBA板看看长不长。r如果不长，就是载体或片段没有切好。如果长，可能是没切好+污染。

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2015-04-09 16:45:55
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huizhang523

银虫 (初入文坛)
★
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一个最有可能的原因是复苏时间较长，感受态效率较高并且使用量较大（有点浪费），可以不复苏直接涂平板，我们都是经常这样做，用50微已经效率很高了；另外一个不容易发生的原因是感受态污染，可以在AMP平板上培养试试
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6楼2015-04-09 22:58:17
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cosmoslight

金虫 (小有名气)
★
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转化后直接涂板，菌太多了

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7楼2015-04-10 16:10:35
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玉雪晴儿

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cosmoslight at 2015-04-10 16:10:35
转化后直接涂板，菌太多了

那请问涂菌的量多少合适呢？制备感受态细胞的时候有没有什么需要注意的重要的地方？
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沿着既定的方向，前进
8楼2015-04-10 16:23:10
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玉雪晴儿

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 浅语8905 at 2015-04-09 14:32:30
涂平板时，少涂些，应该有单菌落。也可能是染菌了

现在是不管涂多少都能长
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9楼2015-04-10 16:25:18
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chunhua0312

铁虫 (初入文坛)
★
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你做好的感受态细胞测定过效价吗？？？空对照做了吗？？
说不定，你挑的菌落就是杂菌。
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绿露
10楼2015-04-10 16:38:41
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